Universidad Nacional de Tumbes Escuela de Postgrado CULTIVO DE MICROALGAS Ing. Edgar López Landavery, MS.c

Criterios de Selección Alimento Disponibilidad Costo de producción Simplicidad Versatilidad FÍSICO Pureza Aceptabilidad NUTRICIONAL Ingerible-Digerible Requerimientos energéticos Requerimientos nutritivos CULTIVO PREDADOR

Cadena de alimentación

Clasificación de Microalgas Cianophyta = microalgas verde-azules Más primitivas Procariontes Pared celular posee cápsulas de proteína-polisacáridos Sólo poseen Clorofila a. Poseen ficobilinas y carotenoides No poseen flagelos Unicelulares, coloniales y filamentos (cianobacterias) Spirulina, Oscillatoria, Anabaena Bacterias Microalgas

CYANOPHYTA

Clorophyta = Algas verdes Grupo más avanzado Eucariotes Pared celular de celulosa Algunas especies con flagelos Poseen clorofila a y b, algunos carotenoides Formas unicelulares y filamentos Tetraselmis, Dunaliella, Chlorella, Chlamydomonas

CHLOROPHYTA Chlorella sp.

Bacillariophyta= Diatomeas Únicos con pared celular de sílice Eucariotes No poseen flagelos Clorofila a y c, algunos carotenoides =fucoxantina Unicelulares y filamentos Chaetoceros, Thalassiosira, Skeletonema, Phaeodactylum

BACILLARIOPHYTA

Chrysophyta= algas pardas Similares características que diatomeas Carecen de pared con sílice Algunas especies con flagelos Clorofila a y c, carotenoides = fucoxantina Formas unicelulares Isochrysis, Nannochloropsis, Monochrysis

Clases y Géneros de Microalgas

Clases y Géneros de microalgas

Condiciones generales de cultivo

Dinámica de crecimiento Crecimiento Poblacional (Núm. De células/ml I II III IV V I. Fase de inducción o retraso del crecimiento II. Fase Exponencial III. Fase de declinación relativa al crecimiento IV. Fase estacionaria V. Fase de muerte Días de cultivo Fase deseada

Requerimientos químicos Macronutrientes Nitrato Fosfato Relación 6:1 Micronutrientes Metales trazas: Co, Cu, Fe, Mn, Zn Vitaminas: B1, B12, Biotina Silicatos: específicos para diatomeas

Tratamiento del Agua de Cultivo Filtración y Esterilización Mecánica Agua claras  filtros de cartucho diferentes m Agua cargadas de partículas Filtro de arena + filtro de diatomeas  filtro de cartucho  ultravioleta

Sistema de Filtración < 20,000 galones Bombas Filtro de arena Filtros 20 a 35 micras 1 a 5 micras Filtro UV Tanque de cultivo Vía opcional

Sistema de Ultrafiltración Opcional UV 1 micra 10 micras Carbón 5 micras Carbón Tanque de Cultivo

Tratamiento del Agua de Cultivo Ultravioleta: flujo es el factor más importante Condición: previa filtración mecánica a 30-35 micras (m) Ozono: en concentraciones altas  cloraminas Rule of thumb  si se lo percibe, suficiente para ocasionar daños a la salud

Tratamiento del Agua de Cultivo Esterilización por calor : Autoclave Método más efectivo Involucra temperaturas de 120 C y 20 psi Tiempo dependiente del volumen 1 L 15 min 20 L 45 min Altas temperaturas CO2 pH  precipitación de nutrientes Microondas: 1 - 1.5 L  84 C  8-10 min Costoso

Tratamiento del Agua de Cultivo Pasteurización Volúmenes < 1000L Temperatura de 73 C  10-15 min Enfriar durante la noche a T C ambiente Repetir el proceso en 24 horas Disminuye la precipitación de nutrientes Relativamente barato Energía solar Volúmenes > 1,000 L Tanques con material aislante (invernadero)

Tratamiento del Agua de Cultivo Clorinación Método más común y simple Hipoclorito de Sodio 2.5 ppm estabilizadores Hipoclorito de Calcio 12-25 ppm 30 min 12-24 horas Desactivación: Tiosulfato de Sodio

Fuentes de contaminación Insectos Lluvia Sistema de agua Fuente de agua Cultivo inicial Fertilización Piedra difusoras Aire Sistema de aire Tanque de cultivo Boca Manos sucias Vidriería

TIPOS DE CULTIVOS

Tipos de Cultivo Cultivo Batch ó Recolección Completa Transferencia de microalgas (antes de la fase estacionaria) a volúmenes mayores enriquecidos De acuerdo a la concentración de la microalga, el inóculo debe ser del 2-10% del final del cultivo Ampliamente utilizado simplicidad y flexibilidad Método confiable, pero no el más eficiente Cosecha cuando se alcanza máxima densidad Calidad de las microalgas menos predecible

Tipos de Cultivo Cultivo Semi-continuo Mantenimiento del cultivo mediante cosechas periódicas parciales, recuperando el volumen original y suplementando con nutrientes Pueden ser interiores o exteriores Duración es impredecible Contaminación con competidores, predadores y/o contaminantes no son útiles Cosechas de volúmenes mayores que el cultivo batch

Tipos de Cultivo Cultivo Continuo Pueden ser operados de dos formas: Nutrientes y agua filtrada adicionados al mismo tiempo que se cosecha Pueden ser operados de dos formas: Cultivo Turbidoestáticos.- concentración de las microalgas fija mediante adición automática de medio fresco Cultivo Quemostático.- Medio de cultivo fresco Suministro a una tasa constante y predeterminada

Métodos de aislamiento y mantenimiento Gota de muestra 1ra dilución 2da dilución 3ra dilución Agar nutritivo Caja de Petri

Esquema de producción Cultivo bach Cosecha Fiola 2 L 10 a 14 días Carboys ó Fundas plásticas 160 L 7 días Cilindro de fibra Tanque 500 L 5,000 L 25,000 L 3 a 7 días

Cuantificación de Microalgas Cuantificación directa Cámaras: Hematocitómetro  2-30  Sedgwick-Rafter  50-100  Palmer Malony  5-150  Speirs Levy  5-75  Petroff Houser 0.5-5  Peso seco: muestra representativa es separada por centrifugación o filtración Resultados expresados en peso seco por volumen

Cuantificación de Microalgas Cuantificación indirecta Coulter Counter: contador electrónico de partícula Espectrofotometría: Clorofila a: Pigmento puede ser examinado por la luz absorbida a 664, 647 y 630 nm Turbidez: Medir absorbancia a 750 nm Disco Secchi: medición de la turbidez que las microalgas imparten Fluorometría: mide clorofila mediante exposición a la luz azul

Material de Cultivo Tipos Materiales Cajas petri Erlenmeyers Carboys Vidrio Plástico Polietileno transparente Policarbonatos Fibra de vidrio Tanques de concreto Tanques de madera (liners) Tanques de tierra (liners) Material puede ser tóxico!!! Tipos Cajas petri Erlenmeyers Carboys Tubos de ensayo Fiolas Fundas plásticas Tanques Piscinas Estanques

Producción de microalgas Cultivo en piscinas Tierra, cemento, liners Fertilizante agrícolas Bloom natural Inóculos monoespecíficos Relativamente barata Contaminación, predación Pobre consistencia y crashes Taiwan: Skeletonema Cultivo algas bénticas Cultivo de Abalon (Haliotis sp), P.vannamei Plástico corrugado, aquamats (sustratos) Especies más cultivadas: Navicula Nitzschia Amphora Tiempo : 1-3 semanas 10 días

Costos de Producción

Valor Nutricional Valor nutricional depende: Tamaño Digestibilidad Producción de compuestos tóxicos Composición bioquímica Proteínas  12 - 35% Lípidos  7.2 - 23% Carbohidratos  4.6 - 23% Contenido de HUFAS, EPA, ARA, DHA, importantes para organismos marinos

Valor Nutricional Concentraciones significativas de EPA Diatomeas: Chaetoceros calcitrans, C. gracilis, S. constatum, T. pseudonana Concentraciones significativas de DHA Prymnesiophyta: Isochrysis sp., P. lutheri, Chroomonas salina Microalgas ricas en ácido ascórbico: 0.11-1.62% Valor nutricional varía de acuerdo a condiciones cultivo Alimentación con diferentes microalgas es superior

Uso de microalgas en Acuicultura Moluscos Bivalvos 30% del costo operacional Requerimiento depende de la producción Semilla Talla comercial Juveniles mayores consumidores Algas utilizadas: Isochrysis sp. , T-Iso, I. Galbana, Chaetoceros gracilis, C. calcitrans, Tetraselmis suecica, Thalasiossira pseudonana, P. lutheri, Skeletonema costatum

Uso de microalgas en Acuicultura Moluscos Bivalvos Combinaciones de flagelados y diatomeas estimulan la metamorfosis Cantidad dependiente de densidad de larvas (cel.µl -1) I. galbana 50 C. calcitrans 250 I. galbana/ C. calcitrans 28/125 I. g/C. cal/T. suecica 33/83/33

Uso de microalgas en Acuicultura Preferencia de cria juevniles en exterior Crecimiento influenciado por la ración de alimento Especie Condiciones de cultivo de las microalgas Condiciones de cultivo de los bivalvos Condiciones prácticas utilizan altas tasas de alimento 5-6% (peso seco de algas/peso vivo de semilla/día)

Uso de microalgas en Acuicultura CAMARONES PENAEIDOS Se alimenta a partir de N5 Algas más utilizadas: Chaetoceros gracilis Skeletonema costatum Tetraselmis spp. Thalasiossira spp. Hábitos alimenticios cambian, disminuyendo consumo de algas Estabilización del agua - “Método del mismo tanque” Algas cultivadas en el mismo tanque, suministro de fertilizantes y uso de energía solar. Japón - Penaeus japonicus

Uso de microalgas en Acuicultura PECES MARINOS “ Técnica del agua verde ” Efectos de las microalgas en el cultivo no es completamente entendido: Estabilizan calidad de agua (O2 y remoción de produuctos metabólicos) Fuente directa de alimento. Polisacaridos estimulan sistema inmune Fuente indirecta de alimento (rotíferos y Artemia) Incremento en la incidencia de alimentación (contraste y dispersión de luz) Control microbiano (alga exudado en agua y/o larva)

Sustitutos de las microalgas

Infraestructura Ambientes internos Cepario: Temperatura : 16 -18º C Volúmen de producción : 20 mL - 3L Sala de carboys Temperatura : 18 - 24º C Volúmen de producción : 30L Sala de lavado y esterilizado Agua de mar y agua dulce

Infraestructura Ambientes externos Sistema de aire Plataforma acondicionada con aireación Cilindros de fibra de vidrio de 1 tn Tanques rectangulares de concreto de 2 tn Sistema de aire Blower de 1,5 HP para cultivos externos Blower de 1 HP para cultivos internos Sistema de abastecimiento de agua de mar Agua directa del mar con bomba de 2 HP Filtros de piola y carbón activado

Metodología Desinfección de línea de agua Cloro activo 800 – 1000 ppm/2 días Enjuagar con agua de mar durante 24 horas Lavado carbón activado Desinfección de línea de aire 100 -300 mL formol en blower, drenar por 30 – 40 minutos Enjuagar con agua dulce 100 – 200 mL de alcohol/1 hora Lavado y esterilización de material Solución de ácido (500 mL HNO3/25 L de agua) por 30 minutos Enjuagar con agua de mar filtrada y potable esterilizada Carboys, cilindros y masivos: 5000 ppm cloro activo y enjuagar

Metodología Preparación de nutrientes Cultivos puros S1: 75 g NaNO3 + 5 g NaH2PO4.H2O S2: 22 g Na2SiO3.5H2O S3: 4.2 g EDTA disódico + 3 g FeCl3.6H2O S4: 0.1 g de Biotina + 0.1 g de Cianocobalimina + 0.5 g de Tiamina Carboys S1: 150g de Nitrato de Sodio y 10g de Fosfato de Sodio industrial S2: 60g de Metasilicato de Sodio industrial S3: 20g de EDTA disódico + 10g de Cloruro férrico Exteriores S1: 600g de Nitrato de Sodio y 40g de Fosfato de Sodio industrial S2:150g de Metasilicato de Sodio industrial S3: 20g de EDTA industrial y 10g de Cloruro Férrico

Metodología Fertilización de los cultivos APLICACIONES SOLUCIONES OBSERVACIONES S1 S2 S3 S4 Cultivos puros (0.5- 3L) 1 ml/L 1ml/L Para los tubos agregar 0,8ml/L de la S2 Cultivos en Carboys (30L) ------ La S3 se prepara en 1gl y se esteriliza a 1L Cultivos exteriores (cilindros y masivo) 100ml/TN 80ml/TN 30ml/TN Las soluciones no se esterilizan

Metodología Siembra Nueva cepa Cepa 3 L 0.5 L producción agar 30 L 200 mL X 7 Cepa 3-4 días 2 días 2 días 3 L 0.5 L producción 2 días agar 30 L X 3 2 días cosecha 0.5-1 tn 2-3 días 2 días 1 tn 5 tn

Metodología Mantenimiento de cepas Preparación del agar Bactoagar al 2 - 2.5 % en agua de mar filtrada y autoclavar Agregar 0.3 mL de las soluciones S1, S2, S3 y S4 Llenar placas con 15-20 mL Siembra en placas Seleccionar la cepa más adecuada Colocar 2 gotas de la cepa y rayar en estrías Incubar de 10 – 15 días: 18-24º C y luz constante Extracción de colonias Colonias libres de bacterias Colocar en medo de cultivo 3-5 días con iluminación

Metodología Limpieza de cepas Conteo celular Alimentación larvaria Diluciones sucesivas hasta 10-4 Mantener a 18º C con iluminación Dejar crecer de 5 a 10 días Conteo celular Hematocitómetro N (Cél/mL) = C*2500 ó N (Cél/mL) = C*50000 Alimentación larvaria Ecuación de dilución (C1V1=C2V2) Incognita = volumen de alga a ser retirado de masivos

GRACIAS