Interacción Antígeno - Anticuerpo Ag-Ac

Características Relación bimolecular No covalente → Reversible Específica

Reacciones de aglutinación Las reacciones de aglutinación consisten en el agrupamiento de una suspensión de partículas que se debe a la reacción entre un Ag presente en las partículas y un anticuerpo específico de él

Cuando el Antígeno (Ag) se halla unido de forma natural a un corpúsculo, como las células sanguíneas o las bacterias; las reacciones Ag-Ac producen aglutinación.

En las reacciones con Ag soluble la aglutinación puede conseguirse uniendo el Ag de forma COVALENTE a corpúsculos inertes, como las partículas de látex o los hematíes tratados con ácido tánico. (Las reacciones de aglutinación son más sensibles que las de precipitación)

Factores que influyen en las reacciones de aglutinación

Carga de las partículas La carga impide la aglutinación, para producirse se han de eliminar previamente las cargas.   Los hematíes, las bacterias y las partículas de latex poseen una carga superficial negativa, y un tratamiento previo x ejemplo de los hematíes con papaína los hace fácilmente aglutinables.

Tipo de Anticuerpo IgG: anticuerpos incompletos IgM: anticuerpos completos(más eficaces)

Concentración de Ag y Ac Cuando se agregan concentraciones crecientes de Ag a una cantidad fija de suero conteniendo Ac específicos a medida que la cantidad de Ag aumenta, la cantidad de Aglutinado aumenta hasta alcanzar un máximo, luego declina. Entre estas 2 zonas se encuentra la Zona de Equivalencia, en donde la relación Ag – Ac permite la formación de grandes redes de CI.   En los antisueros con títulos muy altos de Aglutinación se puede producir un fenómeno de PRO ZONA(exceso de ac.)

El fenómeno de Pro zona, produce reacciones falsas negativas de aglutinación a concentraciones elevadas de Ac como resultante de la mala formación de estructuras de enrejado molecular y por el bloqueo estérico por el exceso de Ac; el uso de diluciones seriadas estándar elimina esta dificultad.

Número de determinantes antigénicos Para la Aglutinación son necesarios antígenos con múltiples determinantes antigénicos, de forma que pueda producirse el entrecruzamiento Así mismo, la disposición de los determinantes antigénicos es importante Los determinantes que se encuentran muy repartidos por toda la molécula producen peores aglutinaciones que los que se encuentran densamente distribuidos.

Temperatura Existe una temperatura óptima para la Aglutinación Algunos se unen mejor al Ac a 37°C y otros a 4°C (crioaglutininas) IgM se une mejor a 27 – 30 °C IgG se une mejor a 37°C El tiempo de incubación es también importante, existiendo tiempos óptimos para cada tipo de reacción.

Tipos de reacción de aglutinación

Reacciones de Aglutinación Directa (o activa) Reacciones de Aglutinación Indirecta (o Pasiva) Reacciones de Aglutinación pasiva reversa o Inhibición de la Aglutinación

Reacciones de aglutinación directa Activa Son aquellas en las que el Antígeno se encuentra en las superficies de corpúsculos naturales, como los hematíes y microorganismos(bacterias) Se utiliza para la detección de los Ac del suero frente a los Ag que se adicionan.

Se puede realizar en tubo o en placa Se puede realizar en tubo o en placa. En estas últimas, se mezcla sobre una placa una suspensión de la bacteria con diversas diluciones del suero. Se agita suave la placa unos minutos y se observa el resultado. El resultado se expresa como la inversa de la mayor dilución que aglutina.

Aglutinación directa

Reacciones de aglutinación indirecta Pasiva Se basan en el empleo de una partícula aglutinante inerte a la cual se le ha unido un Ag (soluble). Los soportes particulados pueden ser Glóbulos rojos (hemaglutinación) o partículas de látex

Proceso de sensibilización Partícula (células, latex..) Ag Partícula sensibilizada con el Ag Ensayo de Aglutinación Partículas Sensibilizadas Ac Aglutinación

Reacciones de Aglutinación pasiva reversa o Inhibición de la Aglutinación Se basan en la inmovilización del anticuerpo, en la superficie de la partícula inerte, siendo este tipo de reacciones particularmente útiles para la detección del Ag en distintos líquidos biológicos, o bien inmovilizar el Ag. Puede inhibirse la aglutinación de hematíes o partículas de látex. Cuando se incuba el Ac con la solución que contiene el Ag, este se liga a los lugares de unión del Ac. A continuación se añaden las partículas recubiertas con Ag. Si no hay aglutinación es porque los lugares de combinación del Ac estaban saturados y no es posible la unión de los Ag particulados y la aglutinación. En este caso la aglutinación indica un resultado negativo y la no aglutinación un resultado positivo.

Inhibición de la aglutinación Ag-Ac Ag particulado INHIBICIÓN DE AGLUTINACIÓN

Ventajas de las reacciones de aglutinación Son sencillas de realizar No requieren ningún equipamiento para su lectura Son rápidas y fáciles de implementar Presentan una mayor sensibilidad que las reacciones de precipitación por lo que las han sustituido en muchos casos. Pero las reacciones de Aglutinación son menos sensibles que las reacciones de ELISA e IFI

Formas de realizar una prueba de aglutinación Las reacciones de aglutinación pueden llevarse a cabo sobre portaobjetos de cristal, en la superficie de tarjetas visualizadoras, en placas de microtitulación y en el interior de tubos de ensayo. Las tarjetas visualizadoras suelen ser de material plástico y en ellas hay impresos unos círculos coloreados. El color de estos círculos está directamente relacionado con el de la partícula empleada. Así pues, si la partícula es blanca, el color de los círculos es negro, y si l partícula es de color oscuro, los círculos son blancos.  

Las placas de microtitulación también son de plástico y consta de una serie de pocillo cuyo fondo es cónico(en V) o redondeado (en U)

Valoración de la aglutinación Las reacciones de aglutinación presentan las ventajas de su alto grado de sensibilidad y de la gran cantidad de antígenos que se pueden detectar mediante estas pruebas, pero tienen el inconveniente de que, con ellas, es difícil cuantificar, es decir, determinar la concentración de la sustancia investigada en la muestra problema.

La mayoría de las veces las pruebas de aglutinación son meramente cualitativas, es decir, solo establecen la presencia o la ausencia de la sustancia buscada en la muestra problema

Una forma de establecer la concentración aproximada de la sustancia buscada en la muestra problema(semi-cuantificar) consiste en preparar diluciones seriadas de la muestra problema, de forma que se disponga de una bateria de diluciones en la que la sustancia investigada esté en concentraciones decrecientes.

El paso siguiente consiste en practicar el ensayo de aglutinación con cada una de las diluciones preparadas. De esta forma, aunque con las primeras diluciones la prueba nos de positiva(haya una aglutinación distinguible), llegará un momento en el que la concentración de la sustancia problema en una dilución sea lo suficientemente pequeña como para que la prueba se torne negativa(no aparezca aglutinación)

Pruebas a realizar en el laboratorio ASTO o Antiestreptolisina “O” Factor Reumatoideo (Artritest) Proteína C Reactiva (PCR)

Pruebas de Aglutinación Con partículas de LATEX

Pruebas a realizar en el laboratorio ASTO o Antiestreptolisina “O” Factor Reumatoideo (Artritest) Proteina C. Reactiva Todas Pruebas de Aglutinación con Partículas de Látex

Proteína C. Reactiva La proteína C. reactiva es una proteína de fase aguda que aumenta rápidamente en respuesta a la inflamación y a la agresión de los tejidos. Es particularmente útil en detección de infecciones ocultas, particularmente en pacientes post operados, también en artritis reumatoidea se eleva la PCR. Es sintetizada en el hígado .Esta proteína formaba un precipitado con el polisacárido C de ciertos neumococos y de ahí procede su nombre.

Tiene la particularidad de provocar el recubrimiento de los gérmenes en un proceso denominado OPSONIZACION y así prepara a los microorganismos para la fagocitosis. Activa el complemento. No es especifica para ninguna enfermedad, solo indica un proceso inflamatorio. No solo indica la intensidad de la enfermedad sino también la respuesta del paciente al tratamiento.

Fundamento del Método La reacción se basa en la aglutinación entre la PCR (Ag) y su correspondiente Ac fijado en la superficie de partículas de látex, visible macroscópicamente.

Sustancias Interferentes Sueros lipémicos y contaminados dan falsos positivos Sueros con alta concentración de factor reumatoide elevan falsamente los títulos de PCR Suero con concentraciones superiores a 200mg/l pueden dar fenómenos de prozona. El suero debe diluirse para ser utilizado Tiempo de reacción mayor al indicado a la técnica dan falsos positivos

Factor Reumatoideo Son inmunoglobulinas dirigidos contra la fracción Fc de las IgG. Son del Tipo IgM anti IgG. Se producen en los lugares donde existe inflamación La determinación de FR es útil en el diagnóstico de artritis reumatoide pero necesariemente debe ir acompañado de la clínica. La prueba también puede ser positiva en otras enfermedades, como el lupus eritematoso sistémico.

Las pruebas de FR están diseñadas para detectar anticuerpos IgM Las pruebas de FR están diseñadas para detectar anticuerpos IgM. Aproximadamente el 80% de los pacientes con artritis reumatoide presentan FR positivo. Aunque lo normal es que no haya factor reumatoide identificable a titulos bajos, un pequeño numero de personas sanas muestran FR a un título muy bajo.

Fundamento del método El FR de tipo IgM se detecta en presencia de gamma globulina(IgG) absorbida sobre un soporte inerte de látex Este Ag se une a los FR produciendo aglutinación de las partículas de látex, visible macroscópicamente

Interferencias Sueros hemolizados Pacientes con enfermedades como hepatitis, sífilis, mononucleosis entre otras Pacientes de edad avanzada

Se pone en contacto el suero del paciente con el reactivo de trabajo, se mezclan bien y se espera 2 minutos y se observa el resultado

ASTO o ASO La titulación del ASO o ASTO es un procedimiento serológico que demuestra la reacción del cuerpo frente a la infección producida por estreptococos del grupo A. Los estreptococos producen una enzima denominada estreptolisina O, que tiene la capacidad de destruir(lisar) los hematíes. Dado que la estreptolisina O es antigénica, el cuerpo reacciona produciendo ASO, un anticuerpo neutralizante.

La cuantificación de los Aso se utiliza para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades como fiebre reumáticas, glomerulonefritis aguda, y otras infecciones estreptocócicas.

Fundamento del método El Aso-látex es una técnica de aglutinación en porta para la detección cualitativa y semicuantitativa de anti-estreptolisina O (ASO) en suero humano. Las partículas de látex recubiertas con estreptolisina O son aglutinadas por los ASO presentes en la muestra del paciente.