Nutrición y Crecimiento Bacteriano FUNDACIÓN H.A BARCELÓ TECNICATURA DE ANÁLISIS CLÍNICOS MICROBIOLOGÍA 1° CUATRIMESTRE 2015 Lic. Maria Andrea Camilletti

- La síntesis de su material celular y la generación de ENERGÍA El objetivo principal de una bacteria es duplicarse, y deberá duplicar todos los componentes celulares. Para ello debe cumplir una serie de requisitos: NUTRIENTES 1 La célula debe estar en un medio que le provea CATABOLISMO (Degradación) 2 METABOLISMO CELULAR ANABOLISMO (síntesis) Los microorganismos deben extraer del medio ambiente las sustancias requeridas para: - La síntesis de su material celular y la generación de ENERGÍA

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES Los microorg difieren en la forma específica en la cual obtienen los sig nutrientes: C (carbono) N (nitrógeno) O (oxígeno) S (azufre) Las bacterias fotosintéticas fabrican su propia fuente de C, mientras que las que no, lo obtienen directamente a partir de compuestos orgánicos.

FUENTE DE CARBONO Doble función: fuente de Energía y fuente de Carbono El carbono es el elemento mayoritario en las macromoléculas

Aerobios obligados o estrictos Requerimiento de O2 para el crecimiento SI NO Aerobios obligados o estrictos Anaerobios Facultativos Si hay O2 lo utilizan Aerotolerantes Pueden crecer en presencia de O2 , pero no lo utilizan Estrictos NO pueden crecer en presencia de O2

REQUERIMIENTOS DE OXÍGENO NO todas las bacterias requieren de O2, podemos encontrar bacterias: Aerobias obligadas o estrictas: Crecen sólo en presencia de O2 ya que dependen de la respiración aeróbica para obtener energía (el O2 funciona como el último aceptor de electrones). Ej. Bacilo de la tuberculosis y algunos bacilos esporulados Anaerobias facultativas: NO requieren de O2 pero cuando está presente lo utilizan como aceptor final de electrones. En ausencia de O2 obtienen energía mediante reacciones de fermentación a través de cadenas respiratorias que no tienen al O2 como aceptor final de electrones. Anaerobias aerotolerantes: NO requieren ni utilizan O2 pero pueden crecer en presencia o ausencia del mismo. Su metabolismo es siempre de tipo fermentativo Anaerobias obligadas o estrictas: NO requieren de O2 pero tampoco lo toleran. Crecen sólo en ausencia de O2

SOD: Presente en Aerobios y Anaerobios facultativos y aerotolerantes Catalasa: Presente en Aerobios y Anaerobios facultativos Ambas ausentes en los anaerobios estrictos

MACRONUTRIENTES Además de C y N, los microorg requieren de P, S, K, Mg, Ca, Na y Fe Necesario para el aa Cys y Met, y vitaminas como Tiamina, Biotina, Ác. Lipoico y coenzima A. La mayor parte del azufre la obtienen de fuentes inorgánicas como sulfatos o sulfitos. Síntesis de proteínas y juega un rol importante en la homeostasis Necesario para síntesis de ác. Nucleicos y fosfolípidos

MACRONUTRIENTES Estabiliza a los ribosomas, células y ác. Nucleicos. Es necesario para la actividad de muchas enzimas Ayuda a estabilizar la pared celular y tiene un rol fundamental en el mantenimiento del calor en las endoesporas Interviene en homeostasis Respiración celular y citocromos

MICRONUTRIENTES También llamados elementos traza: Co, Ni, Cr, Cu, Mn, Se, Zn. Muchos de ellos cumplen un rol fundamental en la estructura de las enzimas Importante Todo aquel compuesto que un microorg NO PUEDE SINTETIZAR, debe ser aportado como nutriente Dichos compuestos orgánicos se denominan Factores de Crecimiento e incluye vitaminas, aa, purinas y pirimidinas

MEDIOS DE CULTIVO: Un medio de cultivo DEBE: Soluciones de nutrientes para el crecimiento de los microorganismos Un medio de cultivo DEBE: Aportar los nutrientes que un microorg específico requiere en la concentración adecuada. Ej: una elevada cc de un nutriente, como un aminoácido puede llegar a inhibir el crecimiento

Cultivo de Bacterias en el Laboratorio

MEDIOS DE CULTIVO Líquidos Sólidos Semi Sólidos Preservación Clasificación Por su finalidad o uso Por su consistencia Preservación Líquidos Enriquecimiento Resucitación Fermentativos Selectivo de Enriquecimiento Sólidos Aislamiento Semi Sólidos Selectivo de Aislamiento Diferenciales Identificación Genéricos

Semi Sólidos Líquidos Sólidos Soluciones acuosas de uno o más componentes. Ej: peptona buffereada, Caldo nutritivo Son medios de cultivo que contienen también un agente solidificante o gelificante como el ágar-ágar, en concentraciones oscilan entre 1-2% Son medios vertidos en forma inclinada, que contienen 0,15% de ágar-ágar. Usualmente se emplean para test de movilidad Ej: ágar-SIM

Preservación Resucitación Enriquecimiento Fermentativos Son medios que preservan y mantienen la viabilidad de los microorganismos por un largo período. Durante el almacenamiento por largos periodos, el medio de preservación protege a los microorg de influencias que le son adversas Medios NO SELECTIVOS ricos en nutrientes que permiten a los microorg deteriorados o debilitados, reparar y recuperar su capacidad para crecer normalmente. Ej: Tripteína Soja ágar con 0,3% de extracto de levaduras Enriquecimiento Fermentativos Son medios líquidos de cultivo que proveen los nutrientes necesarios para la multiplicación de los microorg. Ej: Agua de peptona buffereada o caldo nutritivo Son medios líquidos de cultivo formulados de tal forma que contienen los nutrientes necesarios para obtener el máximo rendimiento de un microorg específico o de un producto de su metabolismo

Selectivo de Enriquecimiento Aislamiento Medios formulados para favorecer la multiplicación de un microorg puntual o de un grupo de ellos, mientras que inhibe total o parcialmente el crecimiento de microorg interferentes acompañantes. Ej: Muller-Kauffman Tetrationato con Novobiocina Son medios de cultivo sólidos que favorecen el crecimiento de microorg. Ej: Ágar en placa Selectivo de Aislamiento Diferenciales Favorece el crecimiento de determinados microorg específicos, mientras que inhibe a los interferentes. Ej: Ágar Mc Conkey Medios de cultivo que permiten evaluar una o más características fisiológicas y/o bioquímicas de los microorg. para permitir su identificación. Ej: Fluorocult o Ágar citrato de Simmons

Identificación Genéricos Medios de cultivo diseñados para producir una reacción de identificación específica que no requiere ningún test de confirmación posterior. Ej: TSI Triple sugar agar Algunos medios pueden asimilarse a varias categorías. Ágar sangre por ejemplo, puede ser utilizado como medio de resucitación, aislamiento, o diferencial para la detección de hemólisis.

Ágar-sangre Ágar MacConkey Streptococcus pneumoniae creciendo en agar columbia nutrido con sangre de caballo. Hemólisis alfa. Cepa mucoide aislado de la conjuntiva de un niño de seis semanas de edad Ágar MacConkey Agar Macconkey con bacterias Lac+ (Izquierda) y Lac- (Derecha

Como fuente de Nutrientes MEDIOS DE CULTIVO Como fuente de Nutrientes SINTÉTICOS COMPLEJOS Se preparan agregando cantidades precisas de determinados químicos. Se usan ocasionalmente cuando se cultivan microorg. con requerimientos nutricionales muy simples Emplean peptonas y/o extractos suplementados con azúcares (glucosa, generalmente) como fuente de C y Energía y un buffer para mantener un pH óptimo para el crecimiento

MEDIOS DE CULTIVO COMPLEJOS A pesar de la diversidad en las aplicaciones y requerimientos, los medios de cultivo complejos tienen una estructura básica, cuyos constituyentes son: Fuente de N Fuente de C Buffers Sales minerales y metales Factores de Crecimiento Cloruro de Sodio Agentes Gelificantes Agentes Selectivos Indicadores

Fuente de N II. Fuente de C III. Buffers aa, peptonas, y/o extractos derivados de hidrolizados de carne, caseína, levadura y vegetales. II. Fuente de C Peptonas (se usa como fuente de N y C) Azúcares (dextrosa, lactosa y otros mono y polisacáridos) III. Buffers Buffers salinos evitan cambios drásticos de pH en el medio (producto de catabolismo o anabolismo), Más usados son el Buffer fosfato y el Buffer Tris

IV. Sales minerales y metales Ca2+, Mg2+, Fe2+, Fe3+ SO42-, PO43- Peptonas, infusiones o extractos V. Factores de crecimiento Nutrientes y protección contra agentes tóxicos (como H2O2 por ej) Sangre, suero, extracto de levaduras, hemina o vitaminas VI. NaCl Se agrega para mantener el balance osmótico en el medio

VII. Agentes gelificantes Ágar-ágar(*) Silicagel Alginato Gelatina El ágar no es inerte, aporta metales minerales y piruvatos VIII. Agentes selectivos Inhiben a los microorg acompañantes sin afectar el crecimiento de los organismos buscados. Ej: ATB Interacción con base nutritiva IX. Indicadores Colorantes indicadores de pH. Muestran los cambios debidos a la utilización de los H de C. Ej Rojo fenol, Rojo neutro

Ágar Sustancia obtenida a partir de algas marinas como Gelidium, Gracilaria, Pterocladia y Ampheltia Químicamente es un galactano, un carbohidrato complejo compuesto por galactosas Forma un gel con una temperatura de gelificación de 40-45°C después del enfriamiento, previo calentamiento hasta fusión a temperaturas de 80-90°C Es un agente solidificante, no es utilizado como nutriente por las bacterias sino como sostén

Factores requeridos para el cultivo de microorganismos Disponibilidad de nutrientes apropiados O2, y otros gases de acuerdo al requerimiento Humedad pH adecuado Temperatura adecuada El medio debe estar libre de microorganismos interferentes Prevención de la contaminación

O2 Aerobios obligados: Requieren la libre entrada de O2 Anaerobios: Crecen solamente en ausencia de O2 atm Microaerófilos: Se desarrollan mejor bajo condiciones parcialmente aeróbicas Anaeróbicos facultativos: Son capaces de crecer en ausencia o presencia de O2

Humedad Los microorg requieren un ambiente acuoso y deben disponer de “agua libre” (agua no ligada a estructuras complejas) La evaporación durante la incubación o el almacenamiento ocasiona una pérdida del “agua libre” y una reducción en el tamaño de las colonias o una total inhibición del crecimiento de los microorg.

Bacterias mesófilas1 y hongos: 25-40°C Temperatura adecuada Bacterias mesófilas1 y hongos: 25-40°C Termófilos: > 45°C Psicrófilos: < 20° C 1Los organismos patógenos son generalmente mesófilos