Journal Club Diagnóstico in vitro de microARN con analizadores de inmunoanálisis A. Kappel, C. Backes, Y. Huang, S. Zafari, P. Leidinger, B. Meder, H. Schwarz, W. Gumbrecht, E. Meese, C.F. Stähler y A. Keller Abril de © Copyright 2015 by the American Association for Clinical Chemistry

Descripción general Desafío La conversión de marcadores moleculares en herramientas clínicamente útiles requiere la normalización y simplicidad de sus mediciones. Los microARN están actualmente por pasar de la investigación a la aplicación Para la rutina clínica, se requieren métodos de laboratorio altamente automatizados y ampliamente disponibles para medir los paneles de microARN Inmunoanálisis de microARN Conversión de medición de los microARN de NGS/micromatriz/RCP-RT cuantitativa a un formato de inmunoanálisis establecido Medición de los microARN en un sistema ya instalado y usado de forma habitual en varios laboratorios centrales 2

Introducción Los nuevos marcadores habitualmente requieren tecnologías nuevas para la aplicación clínica. Los marcadores únicos se combinan cada vez más en firmas. Los microARN actualmente están migrando de investigación básica a aplicación. Con frecuencia, deben evaluarse grupos de 4-20 microARN seleccionados. Los sistemas de pruebas respectivas (micromatriz, RCP-RT cuantitativa, NGS) frecuentemente no están establecidos en la atención habitual.  Un formato de análisis económico, normalizado y ampliamente disponible con capacidad de multiplexación, como el inmunoanálisis, podría promover el traslado de los microARN a la atención habitual. 3

Introducción - Preguntas clave ¿Qué tan "integrada" debe estar una prueba respectiva? ¿De la muestra de sangre al diagnóstico en un sistema? ¿Qué tan rápido migrarán los sistemas complejos como la NGS a la atención habitual, si ocurre la migración? ¿Se realizarán las pruebas respectivas en su mayoría en el centro de asistencia o en los laboratorios centrales? 4

Materiales y métodos Material de inicio: ARN total de 2.5 ml de muestras de sangre en PAXgene El análisis se realiza en el analizador de inmunoanálisis Advia Centaur® Principio del análisis (Figura 1): 5 El ARN total se hibrida al oligonucleótido receptor biotinilado, lo que genera heterohíbridos de ADN/ARN Los heterohíbridos se unen a la fase sólida con etiquetado de estreptavidina El anticuerpo etiquetado con éster de acridinio se agrega a los heterohíbridos de ADN/ARN Detección quimioluminiscente Figura 1. Los 4 pasos principales completamente automatizados llevados a cabo en el analizador de inmunoanálisis. AE, éster de acridinio.

Materiales y métodos - Preguntas clave ¿Es aceptable el tiempo de ejecución del análisis (~1 hora)? ¿Es aceptable el tiempo de obtención de resultados de 3 horas? ¿Qué grado de multiplexación se requiere/resulta aceptable? 6

Resultados Características del análisis: Especificidad técnica: 99.4 % (panel superior derecho) Límite de detección: 1 pmol/l (panel inferior derecho) Rango dinámico de 4 órdenes de magnitud Puede medirse de forma confiable el cambio del 10 % en la concentración La medición en serie de 8 plexaciones permite la detección de perfiles de hasta 8 microARN 7 Figura 2. Especificidad técnica y sensibilidad analítica.

Resultados Prueba de concepto: Identificación de 4 microARN de la enfermedad de Alzheimer: miR p, miR-26a-5p, miR-151a-3p, let-7d-3p ABC para la detección de la enfermedad de Alzheimer: replicaciones de 4 miARN, muestras enriquecidas, en blanco (panel superior derecho) 0.8 % de valores atípicos en todas las mediciones Correlación con RCP-RT cuantitativa de (panel inferior derecho) 8

Resultados - Preguntas clave ¿Son aceptables la especificidad y sensibilidad técnicas? ¿Es suficiente el rango dinámico? ¿Cuáles son los principales obstáculos restantes para la aplicación de las pruebas respectivas en la atención clínica? 9

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