TÉCNICAS de LABORATORIO NEUROMUSCULAR con aplicabilidad clínica INMUNOLOGIA

OBJETIVOS Familiarizarse con las técnicas utilizadas comúnmente Destacar sus utilidades, ventajas e inconvenientes Análisis crítico con ejemplos reales de artículos destacados

RESUMEN Inmunohistoquímica Técnicas basadas en células ELISA Diagnóstica Investigación Screening autoanticuerpos Confirmación de reactividad Técnicas basadas en células Inmunocitoquímica Citometría de flujo ELISA Western-blot Cromatografía de capa fina

INMUNOHISTOQUÍMICA DIAGNÓSTICA

Inmunohistoquímica Inmunohistoquímica: es un procedimiento que se basa en la utilización de un anticuerpo específico, para la localización e identificación de un antígeno en una muestra tisular. 2 tipos de anticuerpos

Inmunohistoquímica Antígenos Anticuerpo 1° Anticuerpo 2°

Inmunohistoquímica Inmunofluorescencia directa Inmunofluorescencia indirecta Utiliza un solo anticuerpo Utiliza un 2° anticuerpo conjugado Anticuerpo 2° Anticuerpo 1° Anticuerpo 1° Antígenos Antígenos

Marcado mediante enzimas Inmunohistoquímica Marcado con fluorocromo Marcado mediante enzimas + sustrato

APLICACIONES Inmunohistoquímica Detectar la presencia/ausencia de una moleculas concretas en un tejido Detectar moleculas que están y no deberían estar Detectar moléculas que no están y deberían estar Analizar el patrón de tinción Si las moléculas están donde tienen que estar y en la proporción adecuada.

DISTROFINA

MHC I

INMUNOHISTOQUÍMICA INVESTIGACIÓN

UTILIDAD Enfermedad inmunes y no inmunes Enfermedades inmunes Demostrar la presencia de anomalias estructurales o la alteración del patrón de tinción de determinadas proteinas relacionadas con la fisiopatología de la enfermedad Enfermedades inmunes Demostrar que el suero/LCR de pacientes reacciona contra un tejido relevante para la enfermedad estudiada.

EJEMPLOS PRIMER CASO

EJEMPLOS SEGUNDO CASO

Ensayos diagnósticos celulares (cell-based assays)

INMUNOCITOQUÍMICA CITOMETRÍA DE FLUJO

Cultivo celular y transfección

Tipos de Cultivo Primarios: provienen de una persona/animal y su crecimiento es limitado. Ej: musculares, endoteliales, neuronas… Líneas: Células immortalizadas, crecimiento ilimitado, amplia utilización en investigación. Ej: HEK, CHO, HeLa….

Cultivo de biopsias musculares de pacientes Cultivo de explantes Separación con CD56+ Proliferación de mioblastos Diferenciación a miotubos

Inmunocitoquímica

Transfección: partículas lipídicas

Procéso immunocitoquímica Célula

Célula

Proyecto de busqueda de nuevos antígenos en CIDP Contactin-1 CASPR1/Contactin-1 (Contactin1 complex) Neurofascin155 Serum Commercial Ab Merged Serum Commercial Ab Merged Serum Commercial Ab Merged

VENTAJAS ICC Expresión proteínas en su conformación nativa Incluye modificaciones post-traduccionales Ideal para proteinas de membrana Permite el estudio de proteinas humanas sobre líneas celulares humanas Permite valorar el patrón de tinción (aspectos cualitativos) Sencillo y relativamente barato. Puede utilizarse de la misma manera o con mínimos cambios para muchas proteínas.

DESVENTAJAS No es útil para complejos de proteínas o proteínas con interacciones complejas Diferencias post-traduccionales respecto a proteina en su tejido de origen (diferente glicosilación, splicing…) No cuantitativo No mecanizable, consume tiempo.

CITOMETRIA DE FLUJO

VENTAJAS En general las mismas que la ICC más Cuantificable Mecanizable

DESVENTAJAS Similares a la ICC, más No permite análisis cualitativo (localización de la tinción…) Discrimina peor reactividad inespecífica

ELISA

ELISA ELISA: es un inmunoensayo para la cuantificación de un antígeno o anticuerpo mediante la inmovilización en una superficie sólida de un anticuerpo o antígeno, respectivamente.

ELISA Tipo Sandwich Indirecta Detección de anticuerpos anti-gangliósidos en suero

ELISA

ELISA

ELISA Dilución punto final (cuando deja de ser positivo)

Analisis resultados Dos formas Determinación pacientes positivos en función de una señal umbral Mejor especificidad Comparación de grupos

VENTAJAS Versátil. Válido para muchos tipos de ensayo Gangliosidos Proteinas Acidos nucleicos Sencillo y barato. Permite muchas determinaciones en poco tiempo Muy bueno para moléculas sencillas, no dependientes de conformación, pero válido para moléculas dependientes de conformación Mayor sensibilidad que otras pruebas diagnósticas Permite titular lo sueros

INCONVENIENTES Resultados variables, muy dependiente de condiciones externas de temperatura, tiempos de incubación, el estado de la molécula analizada… Más reactividad inespecífica, especialmente con sueros. Falsos positivos No válido para moléculas muy dependientes de conformación, por ejemplo, con muchos dominios transmembrana Necesidad de proteinas recombinantes. Proteinas purificadas o ELISA de tejidos, muy sucios.

WESTERN BLOT

WB para Disferlina Western blot Dysferlin Β- actin Control 1 250 150 100 75 50 37 2 Marcador Dysferlin Β- actin

WB para distrofina Western blot 1 2 3 1 2 3 Distrofina ROD (Dys 2) 1 2 3 1 2 3 Distrofina Control Paciente 1 Paciente 2 250KDa ROD (Dys 2) Carboxi (Dys 3) Dys 1 Dys 2 Dys 3

CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

Características de los gangliósidos Glicoesfingolípidos: ceramida + uno o más azúcares (hexosas) Selección de algunos de los gangliósidos relevantes en las neuropatías (neuropatía motora multifocal y los síndromes de neurona motora inferior). 

TLC de gangliósidos lámina de aluminio con gel de sílice

TLC de gangliósidos

Técnicas de determinación Cromatografía en capa fina No permite la cuantificación Mayor especificidad en la determinación Placa Cromatografía silica gel solución de gangliósidos standard revelada con resorcinol incubación con el suero del paciente anti-IgG/IgM humana marcada con peroxidasa revelado por quimioluminiscencia

Técnicas de determinación Cromatografía en capa fina, patrones de reactividad

Interpretación de los resultados DISIALOSIL

INMUNOHISTOQUÍMICA EJERCICIO 1

INMUNOCITOQUÍMICA EJERCICIO 2

NEURONAS DRG – CIDP ATAXICA

ELISA EJERCICIO 3

WESTERN-BLOT EJERCICIO 4

Western blot 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Dysferlin Β- actin 237KDa 42KDa carril 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Dysferlin 237KDa Β- actin 42KDa carril Name DYSF ACTINA DYSF/ACT 100% expresión 1 control 59,06 163,56 0,36109073 100 2 paciente 1 1,17 115,78 0,01010537 2,798568721 3 paciente 2 27,1 95,23 0,28457419 78,80960772 4 paciente 3 38,6 138,89 0,27791778 76,96618955 5 paciente 4 14,94 149,3 0,10006698 27,71241978 6 paciente 5 37,03 136,96 0,27037091 74,8761704 7 paciente 6 26,36 116,77 0,22574291 62,51695042 8 paciente 7 1,97 151,08 0,01303945 3,611128221 9 paciente 8 47,45 159,14 0,29816514 82,5734675

TLC EJERCICIO 5

AMAN

CANOMAD