Alineamiento de secuencias Búsqueda de secuencias en bases de datos Fernán Agüero Instituto de Investigaciones Biotecnológicas Universidad Nacional de General San Martín fernan@iib.unsam.edu.ar 1 Fernán Agüero

Análisis comparativo El alineamiento de secuencias es similar a otros tipos de análisis comparativo. En ambos es necesario cuantificar las similitudes y diferencias (scoring) entre un grupo relacionado de entidades. Finches of the Galápagos Islands observed by Charles Darwin on the voyage of HMS Beagle 2 Fernán Agüero

Homología vs similitud Homología entre dos entes biológicos implica una herencia compartida Homología es un término cualitativo Se es homólogo o no se es Similitud implica una apreciación cuantitativa o una cuantificación directa de algún caracter Podemos usar una medida de similitud para inferir homología 3 Fernán Agüero

GATCATCA GATTGATCA GAT_ACCA Análisis comparativo Los algoritmos que alinean secuencias modelan procesos evolutivos GATTACCA GATGACCA GATTACCA GATTACCA GATTATCA GATCATCA sustitución inserción GATTGATCA deleción GAT_ACCA Deriva de un ancestro común a través de cambios incrementales debido a errores en la replicación del DNA, mutaciones, daño o crossing-over desigual. 4 Fernán Agüero

Análisis comparativo GATTACCA GATGACCA GATTACCA GATTACCA GATTACCA Algoritmos de alineamiento modelan procesos evolutivos GATTACCA GATGACCA GATTACCA GATTACCA GATTACCA GATTATCA GATTACCA Deriva a partir de un ancestro común a través de cambio incremental. GATCATCA GATCATCA GATTGATCA GATTGATCA GATACCA GATACCA Sólo las secuencias actuales son conocidas, las secuencias ancestrales se postulan. 5 Fernán Agüero

Análisis comparativo GATTACCA GATGACCA GATTACCA GATTACCA GATTATCA Algoritmos de alineamiento modelan procesos evolutivos GATGACCA GATTACCA GATTACCA GATTATCA GATTACCA Deriva a partir de un ancestro común a través de cambio incremental. Mutaciones que no matan al individuo pueden pasar a la población. GATCATCA GATTGATCA GATACCA La palabra homología implica una herencia común (un ancestro común), el cual puede ser inferido a partir de observaciones de similitud de secuencia. 6 Fernán Agüero

Cómo alineamos dos secuencias? Alineamientos Qué es un alineamiento? El procedimiento de comparación de dos (o más) secuencias que busca una serie de caracteres individuales o patrones de caracteres que se encuentren en el mismo orden en ambas secuencias Cómo alineamos dos secuencias? a mano (como en los viejos tiempos) usando un método/algoritmo 7 Fernán Agüero

Definición de alineamiento: tipos Cada base se usa a lo sumo una vez Alineamiento global: Todas las bases se alinean con otra base o con un gap (“-”) Alineamientos locales: No hay necesidad de alinear todas las bases Align BILLGATESLIKESCHEESE and GRATEDCHEESE G-ATESLIKESCHEESE or G-ATES & CHEESE GRATED-----CHEESE GRATED & CHEESE 8 Fernán Agüero

Alineamientos buenos y malos? Cuál es el ‘mejor’ alineamiento? GCTACTAG-T-T--CGC-T-TAGC GCTACTAGCTCTAGCGCGTATAGC 0 mismatches, 5 gaps GCTACTAGTT------CGCTTAGC GCTACTAGCTCTAGCGCGTATAGC 3 mismatches, 1 gap 9 Fernán Agüero

Cómo decidir cuál es el mejor? Respuesta: el más significativo desde el punto de vista biológico Pero: necesitamos una medida objetiva sistemas de puntaje (scoring) reglas para asignar puntos el más simple: match, mismatch, gap 10 Fernán Agüero

Un primer ejemplo de scores Ejemplo de sistema de score match = +1 mismatch = 0 gap = -1 G-ATESLIKESCHEESE GRATED-----CHEESE Usando otro sistema de score Score (10 * 2) + (1 * 0) + (5 * (-1)) = +15 Score (10 * 1) + (1 * 0) + (5 * (-1)) = +5 11 Fernán Agüero

No se pueden comparar scores Primera conclusión importante: no tiene sentido comparar scores de distintos alineamientos a menos que se especifique el sistema de scoring utilizado 12 Fernán Agüero

gap extension penalty = -1 Gap penalties gap opening penalty = -5 gap extension penalty = -1 1- Abrir un gap es costoso GCTACTAG-T-T--CGC-T-TAGC GCTACTAGCTCTAGCGCGTATAGC Penalty = 5 * (-5) + 6 * (-1) = -31 2 - Extender un gap es menos costoso GCTACTAGTT------CGCTTAGC GCTACTAGCTCTAGCGCGTATAGC Penalty = 1 * (-5) + 6 * (-1) = -11 13 Fernán Agüero

Dot plots: introducción Dot-plot: Fitch, Biochem. Genet. (1969) 3, 99-108. A C G T C G T A C C G T 1 Eje horizontal: secuencia 1 Eje vertical: secuencia 2 14 Fernán Agüero

Módulos en orden reverso Similitud local Dominios mezclados confunden a los algoritmos de alineamiento. Módulos en el factor XII de coagulación y en el activador de plasminógneos – tissue plasminogen activator (PLAT) FXII F2 E F1 K Catalytic Módulos en orden reverso Módulos repetidos PLAT F1 E K Catalytic F1,F2 Fibronectin repeats E EGF similarity domain K Kringle domain Catalytic Serine protease activitiy 15 Fernán Agüero

Dot plots: ejemplo Coagulation Factor XII (F12) K Catalytic E F1 F2 Tissue Plasminogen Activator (PLAT) 16 Fernán Agüero

Dot plots: ejemplo (cont.) Dominios repetidos muestran un patrón característico. Coagulation Factor XII (F12) F1 E K K Tissue Plasminogen Activator (PLAT) Catalytic F2 E F1 E K Catalytic 17 Fernán Agüero

Dot plots: path graphs Dot plots sugieren caminos (paths) a través del espacio de alineamientos posibles. Dominios EGF conservados en la urokinse plasminogen activator (PLAU) y el tissue plasminogen activator (PLAT) 90 137 90 137 72 23 23 Path graphs son representaciones más explícitas de un alineamiento. Cada path es un alineamiento único. 72 PLAU 90 EPKKVKDHCSKHSPCQKGGTCVNMP--SGPH-CLCPQHLTGNHCQKEK---CFE 137 PLAT 23 ELHQVPSNCD----CLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYE 72 18 Fernán Agüero

Path graphs: encontrar el mejor camino Los problemas que involucran encontrar la mejor ruta o camino (Best-path problems) son comunes en computación científica. Rutear una llamada telefónica desde NY a San Francisco El algoritmo para encontrar el mejor camino entre dos extremos y pasando por varios puntos se llama ‘dynamic programming’ 19 Fernán Agüero

Dynamic programming: introducción Un ejemplo: G A T A C T A G A T T A C C A Construir un alineamiento óptimo entre estas dos secuencias Match: Mismatch: Gap: +1 -1 Utilizando las siguientes reglas de scoring: 20 Fernán Agüero

Dynamic programming: ejemplo Ordenar las dos secuencias en una matriz bidimensional G A T A C T A G A T T Los vértices de cada celda se encuentran entre letras (bases). Needleman & Wunsch (1970) A C C A 21 Fernán Agüero

Dynamic programming: ejemplo (cont.) El objetivo es encontrar la ruta (path) óptimo G A T A C T A G A Desde aquí T T A C Hasta acá C A 22 Fernán Agüero

Dynamic programming: paths posibles Cada path corresponde a un alineamiento único G A T A C T A G A T T A C C A Cuál es el óptimo? 23 Fernán Agüero

Dynamic programming: scores: match El score para una ruta (path) es la suma incremental de los scores de sus pasos (diagonales o lados). G A T A C T A G A alineada con A A Match = +1 T T A C C A 24 Fernán Agüero

Dynamic programming: scores: mismatch El score para una ruta (path) es la suma incremental de los scores de sus pasos (diagonales o lados). G A T A C T A G A A alineada con T T Mismatch = -1 T A C C A 25 Fernán Agüero

Dynamic programming: scores: gaps El score para una ruta (path) es la suma incremental de los scores de sus pasos (diagonales o lados). G A T A C T A G T alineada con NADA A Gap = -1 T T T alineada con NADA A C C A 26 Fernán Agüero

Dynamic programming: paso a paso (1) Extender el path paso por paso G A T A C T A -1 G G – G G – -1 +1 A T T +1 -1 -1 A C C A 27 Fernán Agüero

Dynamic programming: paso a paso (2) Incrementar el path paso a paso G A T A C T A -1 -2 G -1 +1 -2 A T Recordar el mejor subpath que lleva a cada punto en la matriz. T A C C A 28 Fernán Agüero

G A T A C T A G A T T A C C A Dynamic programming: paso a paso (3) Incrementar el path paso a paso G A T A C T A -1 -2 G -1 +1 -2 A +2 T Recordar el mejor subpath que lleva a cada punto en la matriz. T A C C A 29 Fernán Agüero

G A T A C T A G A T T A C C A Dynamic programming: paso a paso (4) Incrementar el path paso a paso G A T A C T A -1 -2 G -1 +1 -2 A -2 +2 T Recordar el mejor subpath que lleva a cada punto en la matriz. T A C C A 30 Fernán Agüero

G A T A C T A G A T T A C C A Dynamic programming: paso a paso (5) Incrementar el path paso a paso G A T A C T A -1 -2 -3 G -1 +1 -2 -1 A -2 +2 +1 T -3 -1 +1 +3 Recordar el mejor subpath que lleva a cada punto en la matriz. T A C C A 31 Fernán Agüero

G A T A C T A G A T T A C C A Dynamic programming: paso a paso (6) Incrementar el path paso a paso G A T A C T A -1 -2 -3 -4 -5 G -1 +1 -1 -2 -3 A -2 +2 +1 -1 T -3 -1 +1 +3 +2 +1 Recordar el mejor subpath que lleva a cada punto en la matriz. T -4 -2 +2 +2 +1 A -5 -3 -1 +1 +3 +2 C C A 32 Fernán Agüero

G A T A C T A G A T T A C C A Dynamic programming: paso a paso (7) Incrementar el path paso a paso G A T A C T A +1 -1 -2 +2 -4 -3 +3 -8 -7 -6 -5 +4 G A T Recordar el mejor subpath que lleva a cada punto en la matriz. T A C C A 33 Fernán Agüero

Dynamic programming: best path Recorrer el camino de atrás hacia adelante para obtener el mejor path y alineamiento. G A T A C T A +1 -1 -2 +2 -4 -3 +3 -8 -7 -6 -5 +4 G A T T A C C A 34 Fernán Agüero

Dynamic programming: alineamiento obtenido Imprimir el alineamiento A A - T C G T T A C C A 35 Fernán Agüero

Dynamic programming: Smith-Waterman El método fue modificado (Smith-Waterman) para obtener alineamientos locales El método garantiza la obtención de un alineamiento óptimo (cuyo score no puede ser mejorado) La complejidad es proporcional al producto de las longitudes de las secuencias a alinear 36 Fernán Agüero

Similitud global y local El algoritmo de programación dinámica puede ser implementado para alineamientos locales o globales. Optimal global alignment Optimal local alignment Smith & Waterman (1981) Las secuencias se alinean en regiones pequeñas y aisladas Needleman & Wunsch (1970) Las secuencias se alinean esencialmente de un extremo a otro 37 Fernán Agüero

Global y local Un algoritmo de alineamiento local, siempre produce alineamientos locales? Un algoritmo de alineamiento global siempre produce alineamientos globales? NO dependiendo del sistema de scoring (scores para match/mismatch/gaps) SW puede producir alineamientos globales dependiendo la penalidad asignada a los gaps en los extremos de un alineamiento global (o alterando significativamente el sistema de scoring) NW puede producir alineamientos locales 38 Fernán Agüero

Un sistema de scoring simple, penaliza por igual cualquier mismatch Matrices Un sistema de scoring simple, penaliza por igual cualquier mismatch Biológicamente tiene sentido penalizar ciertos cambios y ser más permisivo con otros En proteínas: residuos hidrofóbicos reemplazados entre sí. En DNA: transversiones vs transiciones Una matriz no es otra cosa que un sistema de scoring que permite asignar puntajes individuales a cada una de las letras del alfabeto en uso. 39 Fernán Agüero

Matrices Un ejemplo de matriz de scoring podría ser el clásico ejemplo de penalizar más los cambios que alteran las propiedades químicas de un residuo (aa) hidrofóbicos: Ile, Val, Leu, Ala Polares (+): Lys, Arg Polares (-): Glu, Asp Aromáticos: Phe, Tyr, Trp etc. Ile x Val = -1 Ile x Asp = -5 Phe x Tyr = -1 Phe x Gly = -8 40 Fernán Agüero

Matrices derivadas por observación PAM (Dayhoff, 1978) proveen estimaciones de plausibilidad de cambio de un aminoácido en otro en proteínas homólogas derivadas a partir de un grupo de secuencias > 85% similares los cambios de aminoácidos observados son llamados “accepted mutations” Se extrapolan matrices a períodos evolutivos más largos 41 Fernán Agüero

Matrices derivadas por observación BLOSUM (Henikoff) Blocks Amino Acid Substitution Matrices Sustituciones de amino ácidos observadas en un conjunto grande de ‘blocks’ Representan más de 500 familias de proteínas Se agrupan los blocks de acuerdo a su identidad y se generan matrices blocks 80% idénticos -> BLOSUM80 Blocks 60% idénticos -> BLOSUM60 etc 42 Fernán Agüero

Sistemas de scoring: BLOSUM62 Algunas sustituciones son más comunes que otras BLOSUM62 A 4 R -1 5 N -2 0 6 D -2 -2 1 6 C 0 -3 -3 -3 9 Q -1 1 0 0 -3 5 E -1 0 0 2 -4 2 5 G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6 P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4 T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7 V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4 A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V Los scores provienen del la observación de los tipos y frecuencias de sustitución en distintas familias proteicas 43 Fernán Agüero

Sistemas de scoring: BLOSUM62: identidades Las identidades tienen scores positivos, pero algunas son más valoradas que otras. BLOSUM62 A 4 R -1 5 N -2 0 6 D -2 -2 1 6 C 0 -3 -3 -3 9 Q -1 1 0 0 -3 5 E -1 0 0 2 -4 2 5 G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6 P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4 T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7 V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4 A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V 44 Fernán Agüero

Sistemas de scoring: BLOSUM62: sustituciones Algunas sustituciones tienen scores positivos, pero la mayoría son negativos. BLOSUM62 A 4 R -1 5 N -2 0 6 D -2 -2 1 6 C 0 -3 -3 -3 9 Q -1 1 0 0 -3 5 E -1 0 0 2 -4 2 5 G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6 P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4 T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7 V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4 A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V 45 Fernán Agüero

Más matrices PAM BLOSUM Otras Comparación simple de propiedades químicas de amino ácidos Análisis complejos de sustituciones en estructura secundaria de proteínas, a partir de alineamientos estructurales Gonnet (1994). Sustitución de dipéptidos Jones (1994) matriz específica de proteínas transmembrana Algunas de estas matrices sirven para alinear proteínas en base a características estructurales y pueden no ser útiles para análisis evolutivos! 46 Fernán Agüero

Y ahora? Tenemos un método (algoritmo) que nos garantiza un alineamiento óptimo entre dos secuencias Tenemos un sistema de scoring complejo que refleja mejor nuestras ideas biológicas acerca de lo que es un alineamiento 47 Fernán Agüero

Usemos la fuerza bruta Tenemos una base de datos con secuencias Tenemos una secuencia ‘query’ en la que estamos interesados Podemos encontrar secuencias similares al query en la base de datos? Tomar una por una las secuencias de la base de datos Calcular un alineamiento y su score Elegir los mejores alineamientos en base al score Finalmente usar nuestro criterio y evaluar si la/s secuencia/s encotradas son lo suficientemente similares 48 Fernán Agüero

Evaluando alineamientos Qué hacemos cuando estamos comparando dos secuencias que no son claramente similares, pero que muestran un alineamiento prometedor? Necesitamos un test de significancia Tenemos que responder a la pregunta: Cuál es la probabilidad de que un alineamiento similar (con un score similar) ocurra entre proteínas no relacionadas? 49 Fernán Agüero

Estadística de los alineamientos Generar secuencias al azar de la misma longitud y composición que la secuencia query y alinearlas Karlin & Altschul (1990); Altschul et al (1994); Altschul & Gish (1996) Analizar la distribución de scores que se obtiene 50 Fernán Agüero

The Gumbel Extreme value distribution Los valores de score obtenidos no se distribuyen en forma normal E = K mn e -S Número de alineamientos con un score >= S que espero por azar m,n: longitud de las secuencias K,: parámetros estimados a partir de la matriz de scoring y del tamaño de la muestra 51 Fernán Agüero

Observed vs expected Si la base de datos es suficientemente grande y contiene mayoritariamente secuencias no relacionadas la distribución de scores observados debería coincidir bastante con la distribución de scores esperados por azar (Pearson 1998) 52 Fernán Agüero

Tamaño de la base de datos E(S > x) = p(S > x) D El número de alineamientos con un score > S se incrementa linealmente con el tamaño de la base de datos  una secuencia (un alineamiento con un score S) encontrada en una búsqueda contra un genoma bacteriano con 1000-5000 secuencias va a ser 50-250 veces más significativa que un alineamiento con exactamente el mismo score en una base de datos como OWL (250,000 secuencias) Sin embargo, vimos que la base de datos tiene que ser suficientemente grande como para poder estimar P y E  Compromiso 53 Fernán Agüero

Tamaño de la base de datos: un ejemplo Objetivo: encontrar el homólogo en E. coli de la DAHP synthase de B. subtilis E. coli proteome kdsA, E(4283) < 0.00015 Swissprot kdsA, E(74417) < 0.0017 OWL kdsA, E(260784) < 0.0085 El mismo alineamiento, con el mismo score es 50 veces más significativo en la base de datos más chica. 54 Fernán Agüero

Identificar homólogos con eficiencia Buscar en bases de datos pequeñas primero Repetir la búsqueda en una base de datos pequeña con un algoritmo más sensible (fasta3 con ktup 1 o ssearch) Si no hay hits significativos, buscar bases de datos más grandes, como nr (GenPept, TrEMBL) 55 Fernán Agüero

Límites de la estadística En ciertos casos, la estadística de los alineamientos falla Lo que falla son las suposiciones que hicimos para llegar al modelo estadístico que describe - en este caso - la distribución de scores entre secuencias no relacionadas En general se obtienen estimaciones incorrectas de E cuando Se usan penalidades de gap incorrectas Existen regiones de baja complejidad en la secuencia query 56 Fernán Agüero

Evaluando la estadística Mirar el histograma de scores esperados y observados Mirar el E de la secuencia no relacionada con mayor score 57 Fernán Agüero

Evaluando la estadística (cont) Si los histogramas Obs vs Exp coinciden Y si el E del mejor alineamiento no relacionado es ~1 La estimaciones estadísticas están funcionando bien 58 Fernán Agüero

Buscando homólogos en los límites Secuencias homólogas distantes a menudo no tienen similitud estadísticamente significativa Secuencias con regiones de baja complejidad pueden tener similitud estadísticamente significativas, aunque no sean homólogas Secuencias homólogas generalmente son similares sobre toda la longitud de la secuencia o de un dominio Secuencias homólogas comparten un ancestro común Si hay homología entre A y B; entre B y C; y entre C y D, A y D deben ser homólogos, aun cuando no muestren similitud estadísticamente significativa 59 Fernán Agüero

Búsquedas en bases de datos Compara una secuencia (query) contra una base de datos de secuencias > fasta myquery swissprot -ktup 2 Programa query Base de datos Parámetros opcionales Una búsqueda típica tiene 4 elementos básicos. 60 Fernán Agüero

Búsqueda en bases de datos Con el crecimiento exponencial de las bases de datos las búsquedas son cada vez más lentas … > fasta myquery swissprot -ktup 2 searching . . . . . . 61 Fernán Agüero

Database searching > fasta myquery swissprot -ktup 2 La lista de hits provee los ‘títulos’ y scores de las secuencias que fueron seleccionadas por la secuencia ‘query’. > fasta myquery swissprot -ktup 2 The best scores are: initn init1 opt z-sc E(77110) gi|1706794|sp|P49789|FHIT_HUMAN BIS(5'-ADENOSYL)- 996 996 996 1262.1 0 gi|1703339|sp|P49776|APH1_SCHPO BIS(5'-NUCLEOSYL) 412 382 395 507.6 1.4e-21 gi|1723425|sp|P49775|HNT2_YEAST HIT FAMILY PROTEI 238 133 316 407.4 5.4e-16 gi|3915958|sp|Q58276|Y866_METJA HYPOTHETICAL HIT- 153 98 190 253.1 2.1e-07 gi|3916020|sp|Q11066|YHIT_MYCTU HYPOTHETICAL 15.7 163 163 184 244.8 6.1e-07 gi|3023940|sp|O07513|HIT_BACSU HIT PROTEIN 164 164 170 227.2 5.8e-06 gi|2506515|sp|Q04344|HNT1_YEAST HIT FAMILY PROTEI 130 91 157 210.3 5.1e-05 gi|2495235|sp|P75504|YHIT_MYCPN HYPOTHETICAL 16.1 125 125 148 199.7 0.0002 gi|418447|sp|P32084|YHIT_SYNP7 HYPOTHETICAL 12.4 42 42 140 191.3 0.00058 gi|3025190|sp|P94252|YHIT_BORBU HYPOTHETICAL 15.9 128 73 139 188.7 0.00082 gi|1351828|sp|P47378|YHIT_MYCGE HYPOTHETICAL HIT- 76 76 133 181.0 0.0022 gi|418446|sp|P32083|YHIT_MYCHR HYPOTHETICAL 13.1 27 27 119 165.2 0.017 gi|1708543|sp|P49773|IPK1_HUMAN HINT PROTEIN (PRO 66 66 118 163.0 0.022 gi|2495231|sp|P70349|IPK1_MOUSE HINT PROTEIN (PRO 65 65 116 160.5 0.03 gi|1724020|sp|P49774|YHIT_MYCLE HYPOTHETICAL HIT- 52 52 117 160.3 0.031 gi|1170581|sp|P16436|IPK1_BOVIN HINT PROTEIN (PRO 66 66 115 159.3 0.035 gi|2495232|sp|P80912|IPK1_RABIT HINT PROTEIN (PRO 66 66 112 155.5 0.057 gi|1177047|sp|P42856|ZB14_MAIZE 14 KD ZINC-BINDIN 73 73 112 155.4 0.058 gi|1177046|sp|P42855|ZB14_BRAJU 14 KD ZINC-BINDIN 76 76 110 153.8 0.072 gi|1169825|sp|P31764|GAL7_HAEIN GALACTOSE-1-PHOSP 58 58 104 138.5 0.51 gi|113999|sp|P16550|APA1_YEAST 5',5'''-P-1,P-4-TE 47 47 103 137.8 0.56 gi|1351948|sp|P49348|APA2_KLULA 5',5'''-P-1,P-4-T 63 63 98 131.3 1.3 gi|123331|sp|P23228|HMCS_CHICK HYDROXYMETHYLGLUTA 58 58 99 129.4 1.6 gi|1170899|sp|P06994|MDH_ECOLI MALATE DEHYDROGENA 70 48 91 122.9 3.7 gi|3915666|sp|Q10798|DXR_MYCTU 1-DEOXY-D-XYLULOSE 75 50 92 121.9 4.3 gi|124341|sp|P05113|IL5_HUMAN INTERLEUKIN-5 PRECU 36 36 85 121.3 4.7 gi|1170538|sp|P46685|IL5_CERTO INTERLEUKIN-5 PREC 36 36 84 120.0 5.5 gi|121369|sp|P15124|GLNA_METCA GLUTAMINE SYNTHETA 45 45 90 118.9 6.3 gi|2506868|sp|P33937|NAPA_ECOLI PERIPLASMIC NITRA 48 48 92 117.4 7.6 gi|119377|sp|P10403|ENV1_DROME RETROVIRUS-RELATED 59 59 89 117.0 8 gi|1351041|sp|P48415|SC16_YEAST MULTIDOMAIN VESIC 48 48 97 117.0 8 gi|4033418|sp|O67501|IPYR_AQUAE INORGANIC PYROPHO 38 38 83 116.8 8.3 62 Fernán Agüero

E-value Los hits pueden ser ordenados de acuerdo a su E-value o a su Score. El E-value – más conocido como EXPECT value – es una función del score, el tamaño de la base de datos y de la longitud de la secuencia ‘query’. E-value: Número de alineamientos con un score >=S que se espera encontrar si la base de datos es una colección de letras al azar. Ejemplo: En el caso de un score=1 (un match o identidad) debería haber un número enorme de alineamientos. Uno espera encontrar menos alineamientos con un score de 5, 10, etc. Eventualmente, cuando el score es lo suficientemente alto, uno espera encontrar un número insignificante de alineamientos que sean debidos al azar. Valores de E-value menores que 1e-6 (1* 10-6) son generalmente muy buenos para proteínas, mientras que E<1e-2 puede considerarse significativo. Es posible que un hit cuyo E > 1 sea biológicamente importante, aunque es necesario analizarlo más detalladamente para confirmarlo. 63 Fernán Agüero

Búsquedas en bases de datos El detalle de los alineamientos se muestra más abajo > fasta myquery swissprot -ktup 2 >>gi|1703339|sp|P49776|APH1_SCHPO BIS(5'-NUCLEOSYL)-TETR (182 aa) initn: 412 init1: 382 opt: 395 z-score: 507.6 E(): 1.4e-21 Smith-Waterman score: 395; 52.3% identity in 109 aa overlap 10 20 30 40 50 gi|170 MSFRFGQHLIKPSVVFLKTELSFALVNRKPVVPGHVLVCPLRPVERFHDLRPDEVADLF : X: .:.:: :.:: ::..:::::: : : : :..:: :.:..::: gi|170 MPKQLYFSKFPVGSQVFYRTKLSAAFVNLKPILPGHVLVIPQRAVPRLKDLTPSELTDLF 10 20 30 40 50 60 60 70 80 90 100 110 gi|170 QTTQRVGTVVEKHFHGTSLTFSMQDGPEAGQTVKHVHVHVLPRKAGDFHRNDSIYEELQK ....: :.:: : ... ....::: .::::: :::::..::: .:: .:: .: :X.: gi|170 TSVRKVQQVIEKVFSASASNIGIQDGVDAGQTVPHVHVHIIPRKKADFSENDLVYSELEK 70 80 90 100 110 120 120 130 140 gi|170 HDKEDFPASWRSEEEMAAEAAALRVYFQ .. gi|170 NEGNLASLYLTGNERYAGDERPPTSMRQAIPKDEDRKPRTLEEMEKEAQWLKGYFSEEQE 130 140 150 160 170 180 >>gi|1723425|sp|P49775|HNT2_YEAST HIT FAMILY PROTEIN 2 (217 aa) initn: 238 init1: 133 opt: 316 z-score: 407.4 E(): 5.4e-16 Smith-Waterman score: 316; 37.4% identity in 131 aa overlap 10 20 30 40 gi|170 MSFRFGQHLIKPSVVFLKTELSFALVNRKPVVPGHVLVCPLRP-VER :.. :. .v^: :.. ..:::: ::.::::::. ::X : 64 Fernán Agüero

Búsquedas en bases de datos: hashing methods La búsqueda más simple es un gran ejemplo de dynamic programming. Para una secuencia query de N letras, contra una base de datos de M letras, se requieren MxN comparaciones. Query sequence Database sequence 65 Fernán Agüero

Todas las palabras posibles de longitud ktup Hashing methods Hashing es un método común para acelerar búsquedas en bases de datos. MLIIKRDELVISWASHERE query sequence MLI LII Compilar un “diccionario” de palabras a partir de la secuencia ‘query’. Armar un índice con todas las palabras. IIK IKR Todas las palabras posibles de longitud ktup ktup = 3 KRD RDE DEL ELV LVI VIS ISW SWA WAS ASH SHE HER ERE 66 Fernán Agüero

Consulta del hash (índice) Cada palabra tiene asignado un identificador (número entero) único. (Ejemplo para una palabra de 3 letras formada por un alfabeto de 20 letras posibles.) Asignar un código para cada letra: Código(L)= 0 a 19 Para una palabra de 3 letras L1, L2, L3: identificador = Código(L1)*202 + Código(L2)*201 + Código(L3) 3. Armar una lista con las posiciones de cada palabra asociadas al valor (código) que tiene esa palabra. AAA AAB MLI MLJ 1 2 3 1 Position in query sequence of word 67 Fernán Agüero

all overlapping words of size 3 Hashing methods Construir el diccionario de palabras para la secuencia ‘query’ requiere N-2 operaciones. MLIIKRDELVISWASHERE query sequence MLI LII IIK IKR all overlapping words of size 3 KRD RDE DEL ELV La base de datos contiene M-2 palabras y se requiere una sola operación para buscar ... LVI VIS ISW SWA WAS ASH SHE HER ERE 68 Fernán Agüero

Hashing methods Scan the database, looking up words in the dictionary Query sequence Use word hits to determine were to search for alignments fills the dynamic programming matrix in (N-2)+(M-2) operations instead of MxN. Database sequence 69 Fernán Agüero

FASTA searches in a band Hashing methods Scan the database, looking up words in the dictionary Query sequence Use word hits to determine were to search for alignments Database sequence FASTA searches in a band 70 Fernán Agüero

BLAST extends from word hits Hashing methods Scan the database, looking up words in the dictionary Query sequence Use word hits to determine were to search for alignments Database sequence BLAST extends from word hits 71 Fernán Agüero

BLAST: varios HSPs HSP X X Cumulative Score S T Intenta extender el HSP, siempre que la caída del score sea menos que X (bits). Si lo logra, se repite con el próximo pico. S T 72 Fernán Agüero

BLAST: algoritmos 73 Fernán Agüero

FASTA: algoritmos FASTA fastx, fasty Ssearch Prss Tfastx, tfasty protein-protein, DNA-DNA fastx, fasty translated query, protein database Permite frameshifts sólo entre codones (fastx) o dentro de un codón (fasty) Ssearch Una implementación rigurosa del algoritmo de Smith-Waterman (sin heurísticas) Prss Evalua el significado de un alineamiento por permutación de una secuencia Tfastx, tfasty Protein sequence vs DNA database 74 Fernán Agüero

Bioinformatics. Sequence and Genome analysis. Referencias Bioinformatics. Sequence and Genome analysis. David W Mount, CSHL Press (2001) Hugues Sicotte (NCBI) (slides DP) 75 Fernán Agüero

Alineamiento múltiple de secuencias Fernán Agüero Instituto de Investigaciones Biotecnológicas Universidad Nacional de General San Martín 76 Fernán Agüero

Multiple alignment FHIT_HUMAN -----------MS-F RFGQHLIKP-SVVFL KTELSFALVNRKPVV PGHVLV... APH1_SCHPO -----------MPKQ LYFSKFPVG-SQVFY RTKLSAAFVNLKPIL PGHVLV... HNT2_YEAST MILSKTKKPKSMNKP IYFSKFLVT-EQVFY KSKYTYALVNLKPIV PGHVLI... Y866_METJA -----------MCIF CKIINGEIP-AKVVY EDEHVLAFLDINPRN KGHTLV... FHIT_HUMAN MSFRFGQHLIKPSVVFLKTELSFALVNRKPVVPGHVLV... APH1_SCHPO MPKQLYFSKFPVGSQVFYRTKLSAAFVNLKPILPGHVLV... HNT2_YEAST MILSKTKKPKSMNKPIYFSKFLVTEQVFYKSKYTYALVNLKPIV PGHVLI... Y866_METJA MCIFCKIINGEIPAKVVYEDEHVLAFLDINPRNKGHTLV... Un método de alineamiento múltiple verdadero, alinea todas las secuencias al mismo tiempo. 77 Fernán Agüero

Multiple alignment FHIT_HUMAN -----------MS-F RFGQHLIKP-SVVFL KTELSFALVNRKPVV PGHVLV... APH1_SCHPO -----------MPKQ LYFSKFPVG-SQVFY RTKLSAAFVNLKPIL PGHVLV... HNT2_YEAST MILSKTKKPKSMNKP IYFSKFLVT-EQVFY KSKYTYALVNLKPIV PGHVLI... Y866_METJA -----------MCIF CKIINGEIP-AKVVY EDEHVLAFLDINPRN KGHTLV... Un método de alineamiento múltiple verdadero, alinea todas las secuencias al mismo tiempo. Pero no existe un método computacional que pueda realizar esto en tiempo razonable para más de 3 secuencias cortas 78 Fernán Agüero

True multiple alignment Cómo se resuelve un alineamiento múltiple de 3 secuencias? Usando dynamic programming en una matriz tridimensional El problema es el mismo: encontrar el camino óptimo en el espacio 79 Fernán Agüero

Complejidad del algoritmo DP El número de comparaciones que DP tiene que hacer para llenar la matriz (sin usar heurísticas y excluyendo gaps) es el producto de las longitudes de las dos secuencias La complejidad del algoritmo crece en forma exponencial con el número de secuencias Alinear dos secuencias de longitud 300 implica realizar 90,000 comparaciones Alinear tres secuencias de longitud 300 implica realizar 27,000,000 comparaciones 80 Fernán Agüero

MSA: global optimal MSAs MSA (Lipman et al. 1989) http://www.psc.edu/general/software/packages/msa/manual/manual.html Multidimensional dynamic programming Usa heurísticas para reducir el espacio de búsqueda Varios programas: msa_50_150 - Alinea no más de 50 secuencias. (c/u < 150 residuos) msa_25_500 - Alinea no más de 25 secuencias (c/u < 500 residuos) msa_10_1000 - Alinea no más de 10 secuencias (c/u < 1000 residuos) 81 Fernán Agüero

MSA: progressive multiple alignments Alinear todas las secuencias de a pares Usar los scores para construir un árbol filogenético Alinear secuencialmente (siguiendo el orden que sugiere el árbol) las secuencias para producir un MSA No es un verdadero MSA Las secuencias siempre se alinean de a pares 82 Fernán Agüero

MSA: progressive multiple alignments Align all pairs of sequences. APH1_SCHPO HNT2_YEAST Y866_METJA FHIT_HUMAN Pairwise alignments: compute distance matrix FHIT_HUMAN APH1_SCHPO HNT2_YEAST Y866_METJA FHIT_HUMAN APH1_SCHPO 395 HNT2_YEAST 316 380 Y866_METJA 290 300 340 83 Fernán Agüero

Progressive multiple alignments FHIT_HUMAN Guide Tree APH1_SCHPO HNT2_YEAST Y866_METJA Pairwise alignments: compute distance matrix FHIT_HUMAN APH1_SCHPO HNT2_YEAST Y866_METJA FHIT_HUMAN APH1_SCHPO 395 HNT2_YEAST 316 380 Y866_METJA 290 300 340 84 Fernán Agüero

Alinear las dos secuencias más cercanas Multiple alignment FHIT_HUMAN MSFRFGQHLIKPSVVFLKTELSFALVNRKPVVPGHVLV... APH1_SCHPO MPKQLYFSKFPVGSQVFYRTKLSAAFVNLKPILPGHVLV... HNT2_YEAST MILSKTKKPKSMNKPIYFSKFLVTEQVFYKSKYTYALVNLKPIVPGHVLI... Y866_METJA MCIFCKIINGEIPAKVVYEDEHVLAFLDINPRNKGHTLV... FHIT_HUMAN MSFR FGQHLIKP-SVVFL KTELSFALVNRKPVV PGHVLV... APH1_SCHPO MPKQ LYFSKFPVGSQVFY RTKLSAAFVNLKPIL PGHVLV... HNT2_YEAST MILSKTKKPKSMNKPIYFSKFLVTEQVFYKSKYTYALVNLKPIVPGHVLI... Y866_METJA MCIF CKIINGEIPAKVVYEDEHVLAFLDINPRNKGHTLV... Desde el punto de vista del alineamiento del primer par, el gap puede insertarse en cualquier lugar Alinear las dos secuencias más cercanas El alineamiento genera un consenso que se utiliza para alinear las secuencias que quedan. 85 Fernán Agüero

Alinear las dos secuencias más cercanas Multiple alignment FHIT_HUMAN -----------MSF RFGQHLIKP-SVVFL KTELSFALVNRKPVV PGHVLV... APH1_SCHPO -----------MPK QLYFSKFPVGSQVFY RTKLSAAFVNLKPIL PGHVLV... HNT2_YEAST MILSKTKKPKSMNK PIYFSKFLVTEQVFY KSKYTYALVNLKPIV PGHVLI... Y866_METJA MCIF CKIINGEIPAKVVYEDEHVLAFLDINPRNKGHTLV... FHIT_HUMAN MS-F RFGQHLIKP-SVVFL KTELSFALVNRKPVV PGHVLV... APH1_SCHPO MPKQ LYFSKFPVG-SQVFY RTKLSAAFVNLKPIL PGHVLV... HNT2_YEAST MILSKTKKPKSMNKPIYFSKFLVTEQVFYKSKYTYALVNLKPIVPGHVLI... Y866_METJA MCIFCKIINGEIP-AKVVYEDEHVLAFLDINPRNKGHTLV... Una vez insertado el gap no se puede mover porque es parte del consenso. Alinear las dos secuencias más cercanas 86 Fernán Agüero

Alinear la secuencia siguiente Multiple alignment FHIT_HUMAN -----------MS-F RFGQHLIKP-SVVFL KTELSFALVNRKPVV PGHVLV... APH1_SCHPO -----------MPKQ LYFSKFPVG-SQVFY RTKLSAAFVNLKPIL PGHVLV... HNT2_YEAST MILSKTKKPKSMNKP IYFSKFLVT-EQVFY KSKYTYALVNLKPIV PGHVLI... Y866_METJA MCIFCKIINGEIPAKVVYEDEHVLAFLDINPRNKGHTLV... FHIT_HUMAN -----------MSFR FGQHLIKP-SVVFL KTELSFALVNRKPVV PGHVLV... APH1_SCHPO -----------MPKQ LYFSKFPVGSQVFY RTKLSAAFVNLKPIL PGHVLV... HNT2_YEAST MILSKTKKPKSMNKP IYFSKFLVTEQVFY KSKYTYALVNLKPIV PGHVLI... Y866_METJA -----------MCIF CKIINGEIPAKVVY EDEHVLAFLDINPRN KGHTLV... Alinear la secuencia siguiente Con suerte, el resultado llegue a ser similar al resultado que obtenido por un veradero método de alineamiento múltiple. Debido al orden de los alineamientos, la posición del gap no puede cambiarse para alinear estas dos Prolinas (lo cual hubiera resultado en un score mayor. 87 Fernán Agüero

clustalW Clustalw is a progressive multiple alignment tool. Adaptive gap opening and extension scores Choice of DNA or protein gap penalty alignments. Available on the web or on PC / Mac / unix. http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/multi-align/options/clustalw.html 88 Fernán Agüero

MSA: métodos iterativos Distintos programas implementan distintas estrategias Se realinean subgrupos de secuencias en forma repetida, buscando optimizar el score final del MSA MultAlin (Corpet 1988) PRRP (Gotoh, 1996) DIALIGN (Morgenstern et al. 1996) 89 Fernán Agüero

MSA: algoritmo genético SAGA (Notredame & Higgins, 1996) Sequence Alignment by Genetic Algorithm Genera diferentes MSAs por rearreglos que simulan inserciones de gaps similares a los que ocurren durante la replicación del DNA El proceso continúa hasta que converge en un score que no puede ser mejorado Los MSAs no tienen garantía alguna de ser óptimos Sin embargo, los alineamientos que produce este método son similares a los que se obtienen por otros métodos 90 Fernán Agüero

Query-anchored alignments (master slave) Clustalw: Produce MSAs Blast: No produce MSAs, pero puede mostrar los alineamientos de a pares de una forma que parece un alineamiento múltiple, aunque todas las secuencias estén alineadas con la primera.! Los gaps en el query quieren decir que nada se pudo alinear en este lugar. ABCD AQCD ABQD A - C F - - QC K WC ELVC ELVI QLVI ELVK Esta columna no está alineada. Se muestra por conveniencia Gaps en el subject 91 Fernán Agüero

Bases de datos de alineamientos Pir-ALN http://www-nbrf.georgetown.edu/pirwww/search/textpiraln.html Alineamientos anotados derivados de PIR Incluye alineamientos al nivel de superfamilia, familia y dominio 3983 alineamientos, 1480 superfamilias, 371 dominios Protomap http://www.protomap.cs.huji.ac.il Clasificación automática de proteínas en Swissprot en grupos (clusters) de proteínas relacionadas Tiene organización jerárquica para distinguir sub y super familias COG http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG Clusters of Orthologous Groups of Proteins Proteomas completos Contiene alineamientos de cada COG 92 Fernán Agüero

Local MSAs BLOCKS Representan regiones conservadas de un MSA global http://blocks.fhcrc.org/blocks Representan regiones conservadas de un MSA global No incluyen gaps Una serie de blocks conservados pueden describir la pertenencia o no a una familia Pueden buscar usando una secuencia Pueden usar un MSA para generar blocks 93 Fernán Agüero

Información representada en un MSA Un MSA contiene información acerca de las secuencias que lo componen Si representa a una familia de proteínas: regiones conservadas residuos conservados Qué cosas podemos hacer con esta información? Muchas Qué cosas no deberíamos hacer con esta información? Generar un consenso 94 Fernán Agüero

Consensos Un consenso derivado de un MSA contiene para cada posición el residuo más frecuente OPS2_DROME MERSHLPETP FDLAHSGP-- RFQ-AQSSGN GSV---LDNV LPDMAHLVNP OPS2_DROPS MERSLLPEPP LAMALLGP-- RFE-AQTGGN RSV---LDNV LPDMAPLVNP OPS2_LIMPO ---------- -MANQLSY-- SSLGWPYQPN ASV---VDTM PKEMLYMIHE OPS2_HEMSA ----MTNATG PQMAYYGA-- ASMDFGYPEG VSI---VDFV RPEIKPYVHQ OPS2_SCHGR ---------- -MVNTTDFYP VPAAMAYESS VGLPLLGWNV PTEHLDLVHP OPS2_PATYE ----MPFPLN RTDTALVISP SEFRIIGIFI SICCIIGVLG NLLIIIVFAK Consenso MERSMLPETP ?MMA?LGP?P … Problemas! 95 Fernán Agüero

Usos de los MSAs Para extraer / generar Patterns/Motifs Profiles Fingerprints Position Specific Scoring Matrices HMMs Para qué extraer / generar patterns, motifs, etc, etc? Para clasificar Para alinear secuencias Para buscar secuencias similares por métodos más sensibles 96 Fernán Agüero

Cómo describir/representar las características salientes de un motif? Motifs Webster's New Collegiate Dictionary: mo-tif n[F, motive, motif] 1 a: a usu. recurring salient thematic element in a work of art; esp: a dominant idea or central theme En secuencias biológicas un motif es un patrón recurrente (común) en una serie de secuencias relacionadas Los MSAs permiten distinguir regiones de evolución lenta (conservadas) y otras de evolución más rápida en un grupo de secuencias Cómo describir/representar las características salientes de un motif? 97 Fernán Agüero

Usando expresiones regulares Patterns Descripción (usando una sintaxis particular) de una región corta que tenga relevancia funcional Cómo se construye un pattern A partir de la literatura. Se testea contra Swissprot A partir de Enzyme catalytic sites Prostethic group attachment sites (heme, pyridoxal-phosphate, biotin, etc) Amino acids involved in binding a metal ion Cysteines involved in disulfide bonds Regions involved in binding a molecule (ADP/ATP, GDP/GTP, calcium, DNA, etc.) or another protein http://www.expasy.ch/prosite 98 Fernán Agüero

El pattern es una expresión regular: [AC]-x-V-x(4)-{ED} Patterns Residuos funcionales importantes El pattern rescata sólo las secuencias correctas MSA Encontrar 4-5 residuos conservados Buscar en Swissprot Core pattern El pattern rescata muchos falsos positivos. Incrementar el pattern y volver a testear. El pattern es una expresión regular: [AC]-x-V-x(4)-{ED} ala/cys-any-val-any-any-any-any-(any except glu or asp) http://www.expasy.ch/prosite 99 Fernán Agüero

Profiles MSA Profile Representan un MSA en forma de tabla Cada posición en el alineamiento corresponde a una fila en el profile Para cada posición en el alineamiento el profile contiene la información de frecuencias de aminoácidos que ocurren en esa posición Esta información se encuentra representada en forma de scores y penalties e incluye a gaps Un profile no es otra cosa que una serie de matrices de scoring, una para cada posición en el alineamiento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 Profile 101 Fernán Agüero

Un MSA particular ATP binding RNA helicase ("DEAD" box family) 102 rhle_ecoli GVDVLVATPG RLLDLEHQNA ....VKLDQV EILVLDEADR MLDMGFIHDI dbp2_schpo GVEICIATPG RLLDMLDSNK ....TNLRRV TYLVLDEADR MLDMGFEPQI dbp2_yeast GSEIVIATPG RLIDMLEIGK ....TNLKRV TYLVLDEADR MLDMGFEPQI dbpa_ecoli APHIIVATPG RLLDHLQKGT ....VSLDAL NTLVMDEADR MLDMGFSDAI rm62_drome GCEIVIATPG RLIDFLSAGS ....TNLKRC TYLVLDEADR MLDMGFEPQI p68_human GVEICIATPG RLIDFLECGK ....TNLRRT TYLVLDEADR MLDMGFEPQI rhlb_ecoli GVDILIGTTG RLIDYAKQNH ....INLGAI QVVVLDEADR MYDLGFIKDI yn21_caeel RPHIIVATPG RLVDHLENTK ...GFNLKAL KFLIMDEADR ILNMDFEVEL yhm5_yeast KPHIIIATPG RLMDHLENTK ...GFSLRKL KFLVMDEADR LLDMEFGPVL me31_drome KVQLIIATPG RILDLMDKKV ....ADMSHC RILVLDEADK LLSLDFQGML drs1_yeast RPDIVIATPG RFIDHIRNSA ...SFNVDSV EILVMDEADR MLEEGFQDEL if4a_rabit APHIIVGTPG RVFDMLNRRY ....LSPKYI KMFVLDEADE MLSRGFKDQI if41_human APHIIVGTPG RVFDMLNRRY ....LSPKYI KMFVLDEADE MLSRGFKDQI vasa_drome GCHVVIATPG RLLDFVDRTF ....ITFEDT RFVVLDEADR MLDMGFSEDM srmb_ecoli NQDIVVATTG RLLQYIKEEN ....FDCRAV ETLILDEADR MLDMGFAQDI dead_ecoli GPQIVVGTPG RLLDHLKRGT ....LDLSKL SGLVLDEADE MLRMGFIEDV if4a_orysa GVHVVVGTPG RVFDMLRRQS ....LRPDYI KMFVLDEADE MLSRGFKDQI dead_klepn GPQIVVGTPG RLLDHLKRGT ....LDLSKL SGLVLDEADE MLRMGFIEDV pl10_mouse GCHLLVATPG RLVDMMERGK ....IGLDFC KYLVLDEADR MLDMGFEPQI p54_human TVHVVIATPG RILDLIKKGV ....AKVDHV QMIVLDEADK LLSQDFVQIM if4a_drome GCHVVVGTPG RVYDMINRKL .....RTQYI KLFVLDEADE MLSRGFKDQI ded1_yeast GCDLLVATPG RLNDLLERGK ....ISLANV KYLVLDEADR MLDMGFEPQI ms16_yeast RPNIVIATPG RLIDVLEKYS ...NKFFRFV DYKVLDEADR LLEIGFRDDL pr28_yeast GCDILVATPG RLIDSLENHL ....LVMKQV ETLVLDEADK MYDLGFEDQV if4n_human GQHVVAGTPG RVFDMIRRRS ....LRTRAI KMLVLDEADE MLNKGFKEQI an3_xenla GCHLLVATPG RLVDMMERGK ....IGLDFC KYLVLDEADR MLDMGFEPQI dbp1_yeast GCDLLVATPG RLNDLLERGK ....VSLANI KYLVLDEADR MLDMGFEPQI if4a_yeast DAQIVVGTPG RVFDNIQRRR ....FRTDKI KMFILDEADE MLSSGFKEQI spb4_yeast RPQILIGTPG RVLDFLQMPA ....VKTSAC SMVVMDEADR LLDMSFIKDT if4a_caeel GIHVVVGTPG RVGDMINRNA ....LDTSRI KMFVLDEADE MLSRGFKDQI pr05_yeast GTEIVVATPG RFIDILTLND .GKLLSTKRI TFVVMDEADR LFDLGFEPQI if42_mouse APHIVVGTPG RVFDMLNRRY ....LSPKWI KMFVLDEADE MLSRGFKDQI dhh1_yeast TVHILVGTPG RVLDLASRKV ....ADLSDC SLFIMDEADK MLSRDFKTII db73_drome KADIVVTTPG RLVDHLHATK ...GFCLKSL KFLVIDEADR IMDAVFQNWL yk04_yeast GCNFIIGTPG RVLDHLQNTK VIKEQLSQSL RYIVLDEGDK LMELGFDETI ybz2_yeast SGQIVIATPG RFLELLEKDN .TLIKRFSKV NTLILDEADR LLQDGHFDEF yhw9_yeast KPHFIIATPG RLAHHIMSSG DDTVGGLMRA KYLVLDEADI LLTSTFADHL glh1_caeel GATIIVGTVG RIKHFCEEGT ....IKLDKC RFFVLDEADR MIDAMGFGTD ATP binding RNA helicase ("DEAD" box family) 102 Fernán Agüero

Un profile generado a partir del MSA Cons A B C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y Z Gap Len .. G 17 18 0 19 14 -22 31 0 -9 12 -15 -5 15 10 9 6 18 14 1 -15 -22 11 100 100 P 18 0 13 0 0 -12 13 0 8 -3 -3 -1 -2 23 2 -2 12 11 17 -31 -8 1 100 100 H 5 24 -12 29 25 -20 8 32 -9 9 -10 -9 22 7 30 10 0 4 -8 -20 -7 27 100 100 I -1 -12 6 -13 -11 33 -12 -13 63 -11 40 29 -15 -9 -14 -15 -6 7 50 -17 8 -11 100 100 V 3 -11 1 -11 -9 22 -3 -11 46 -9 37 30 -13 -3 -9 -13 -6 6 50 -19 2 -8 100 100 V 5 -9 9 -9 -9 19 -1 -13 57 -9 35 26 -13 -2 -11 -13 -4 9 58 -29 0 -9 100 100 A 54 15 12 20 17 -24 44 -6 -4 -1 -11 -5 12 19 9 -13 21 19 9 -39 -20 10 100 100 T 40 20 20 20 20 -30 40 -10 20 20 -10 0 20 30 -10 -10 30 150 20 -60 -30 10 100 100 P 31 6 7 6 6 -41 19 11 -9 6 -16 -11 0 89 17 17 24 22 9 -50 -48 12 100 100 G 70 60 20 70 50 -60 150 -20 -30 -10 -50 -30 40 30 20 -30 60 40 20 -100 -70 30 100 100 ! 11 R -30 10 -30 0 0 -50 -30 50 -30 80 -40 20 10 30 40 150 10 -10 -30 140 -60 20 100 100 L -2 -17 -15 -18 -12 38 -13 -9 38 -12 49 39 -15 -9 -9 -15 -11 0 38 6 12 -10 100 100 L 0 -12 -15 -14 -9 32 -12 -7 32 -7 41 35 -11 -9 -6 -12 -9 0 29 6 9 -7 100 100 D 15 58 -27 78 54 -52 35 27 -12 16 -26 -21 38 6 41 3 9 10 -12 -57 -25 50 100 100 L -5 -5 -7 -8 -4 24 -12 13 13 -6 25 17 -1 -7 0 -2 -8 -3 10 11 17 -2 100 100 L 3 -13 -13 -13 -8 31 -11 -8 34 -9 41 36 -12 -7 -5 -13 -8 2 31 -1 8 -6 100 100 E 6 19 -15 23 27 -21 9 15 -6 18 -8 -1 16 6 23 12 6 5 -6 -15 -16 25 100 100 K 3 14 -12 11 12 -16 2 10 -5 23 -7 4 15 6 15 22 8 3 -5 7 -15 14 100 100 G 11 17 0 16 14 -16 19 5 -6 11 -11 -5 16 9 8 4 14 15 -1 -13 -14 11 100 100 T 12 9 -1 7 7 -8 9 2 4 12 0 4 10 5 4 3 9 12 7 -8 -8 5 100 100 ! 21 D 1 1 0 2 1 -1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 2 -3 -1 1 22 22 T 2 2 0 3 2 -2 3 0 2 0 0 0 1 1 1 -1 1 4 2 -5 -2 2 22 22 K 0 1 -3 0 1 0 0 0 1 4 1 3 1 0 1 1 0 3 1 0 -2 1 22 22 G 3 3 0 4 4 -1 6 -1 3 0 1 1 3 1 1 -2 4 3 5 -6 -3 2 22 22 L 5 -6 -4 -7 -4 16 -2 -4 21 -4 23 17 -5 -4 -4 -8 -2 4 19 0 6 -4 22 22 B 5 16 -6 15 11 -15 10 6 -3 16 -8 -1 15 4 9 10 12 7 -2 -3 -11 10 100 100 L 1 -13 -12 -14 -9 27 -8 -7 24 -8 36 30 -10 -5 -7 -10 -4 7 23 6 9 -8 100 100 D 7 19 -7 22 17 -22 13 7 -6 19 -11 -3 14 8 15 14 17 6 -5 -5 -18 16 100 100 K 11 10 -3 10 9 -12 5 9 -4 16 -6 0 10 6 11 12 10 4 -4 3 -8 10 100 100 V 7 -10 11 -11 -10 14 0 -8 31 -11 19 16 -10 0 -10 -12 2 8 34 -22 9 -10 100 100 K 8 9 -4 9 9 -13 11 1 0 16 -4 4 8 7 8 11 13 12 3 -2 -15 8 100 100 L 3 4 -9 3 6 3 -2 8 9 7 10 10 5 0 8 3 0 5 7 -2 0 7 100 100 L 1 -13 -13 -13 -9 32 -11 -7 32 -9 42 36 -12 -7 -6 -13 -9 3 33 2 8 -7 100 100 * 99 0 25 208 120 94 137 44 181 105 256 94 41 62 64 144 59 99 162 3 35 0 103 Fernán Agüero

Derivación de motifs (patterns) Generación de un MSA Usos de los profiles Derivación de motifs (patterns) Generación de un MSA partiendo de un MSA que se supone representativo de una familia o grupo de proteínas, se genera un profile el profile se usa para generar alineamientos nuevos con proteínas no representadas originalmente en el profile Más sensible que una matriz de scoring sitio-inespecífica Búsqueda de secuencias similares en bases de datos El ‘query’ no es una secuencia, sino el profile 104 Fernán Agüero

Profile HMMs La información contenida en un profile puede representarse de otras formas Los profiles originales contienen scores y penalidades basados en las frecuencias de ocurrencia Un profile (o un MSA) puede representarse como una cadena de eventos con probabilidades de ocurrencia (Markov Model) Veamos un ejemplo! 105 Fernán Agüero

Profile HMMs 106 Fernán Agüero

Profiles vs Profile HMMs Qué propiedad adicional agrega un HMM a un profile? El profile modela un MSA en base a frecuencias sitio-específicas Pero todos los sitios son independientes Un profile HMM agrega probabilidades a posteriori (Bayesian statistics) Probabilidades complejas La probabilidad de que el próximo aa en el MSA sea Alanina no es fija, depende eventos anteriores 107 Fernán Agüero

Paquete de programas para trabajar con profile HMMs Profile HMMs: HMMER HMMER http://hmmer.wustl.edu Paquete de programas para trabajar con profile HMMs genera profile HMMs a partir de MSAs usa los HMMs para realizar búsquedas en bases de datos de secuencias puede buscar en bases de datos de profile HMMs a partir de una secuencia 108 Fernán Agüero

Una base de datos de profile HMMs (y de MSAs) Pfam Una base de datos de profile HMMs (y de MSAs) WUSTL Sanger Centre Karolinska Institutet Representan dominios proteicos Pueden buscar a partir de palabras clave a partir de una secuencia Pfam 8.0 (February 2003, 5193 families) 109 Fernán Agüero

Pfam: HMMs 110 Fernán Agüero

PSSMs [AC]-x-V-x(4)-{ED} Los motifs se pueden representar de distintas maneras (patterns por ejemplo) Sin embargo, los patterns no les dan peso a las distintas sustituciones [AC]-x-V-x(4)-{ED} Una Position Specific Scoring Matrix es una descripción de un motif en términos de una matriz 111 Fernán Agüero

Evaluar la información que contiene una PSSM usando Sequence Logos PSSMs Evaluar la información que contiene una PSSM usando Sequence Logos http://www.lecb.ncifcrf.gov/~toms/sequencelogo.html 112 Fernán Agüero

Protein Fingerprints DB http://www.bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/PRINTS Qué es un fingerprint? Una serie de motifs conservados en un orden particular Se utilizan para predecir la ocurrencia de motifs similares en una secuencia Importa la presencia y el orden de los motifs Una proteína de la misma familia tiene todos los motifs en orden. En el caso de una superfamilia, miembros de distintas familias pueden tener matchs parciales contra el fingerprint 113 Fernán Agüero

InterPro Integra varias otras bases de datos en un solo lugar y provee referencias a otras bases de datos (GO) http://www.ebi.ac.uk/interpro Prosite, PRINTS, Pfam, ProDom, SMART 115 Fernán Agüero

MSA: frecuencias de sustitución de aas Un MSA es la base para determinar las frecuencias de sustitución de amino ácidos en un grupo particular de secuencias frecuencias de sustitución globales Se utilizan para generar matrices de scoring: Matrices PAM, BLOSUM, etc Dan puntaje y penalizan por igual los mismos cambios, independientemente del contexto frecuencias de sustitución sitio por sitio Position Specific Scoring Matrices (PSSM) Profiles 120 Fernán Agüero

Y en general también vale la inversa (buscar usando secuencias) Cómo los uso? Así como BLAST/FASTA pueden buscar sobre secuencias utilizando secuencias, distintos programas pueden buscar sobre secuencias usando patterns motifs profiles PSSMs etc. Y en general también vale la inversa (buscar usando secuencias) Vamos a ver ejemplos en el TP de EMBOSS 121 Fernán Agüero