“Estudio de las moléculas de adhesión en condiciones fisiológicas y patológicas” Dra. Consuelo Macías Abraham Instituto de Hematología e Inmunología

Hipótesis Las moléculas de adhesión se encuentran implicadas en la actividad y regulación funcional de las células NK humanas y en la fisiopatogenia de las enfermedades que cursan con inflamación y activación del endotelio vascular por procesos oclusivos de diferente origen como son el Síndrome coronario agudo y la Anemia drepanocítica

Objetivos Específicos -Evaluar los niveles de expresión y la actividad funcional de las moléculas de adhesión β 2 integrinas leucocitarias y VLA-4 en las células NK humanas en diferentes estados de activación. -Estimar los niveles de concentración de las moléculas de adhesión endoteliales solubles ICAM-1, E-selectina y VCAM-1 en los enfermos con SCA y analizar su relación con el daño miocárdico. -Evaluar las posibles alteraciones de las moléculas de adhesión leucocitarias, endoteliales y en hematíes en enfermos con AD en sus dos estados clínicos, estado basal y crisis vasooclusivas dolorosas (CVOD) y analizar su implicación en la fisiopatogenia de la enfermedad.

Anti CD11aAnti CD49dX % % % % % % Anti CD11b Anti CD11c % % % % Histogramas de citometría de flujo de (A) Células NK frescas y (B) cultivadas después de la incubación con IL-2 (20-50 u/m) durante 3 días (células LAK). A B

(A) Células LAK (30% de agregación) en presencia de IL-2. (B) Células LAK no agregadas en presencia de AcMos contra la molécula LFA-1 e IL-2. (C) Células NK frescas no agregadas en presencia del AcMos anti-  4 (HP1/7), AcMos inhibidores para la molécula LFA-1 e IL-2. (D) Agregación celular (60%) inducida sobre células LAK mediante el AcMo anti-  4 (HP1/7) en presencia de AcMos específicos contra la molécula LFA-1 e IL2. (E) Agregación celular (70%) inducida sobre células cultivadas mediante AcMo anti-  4 (HP2/4) en presencia de AcMos dirigidos contra la molécula LFA-1 e IL-2. (F) Células LAK no agregadas (10%) en presencia de AcMos dirigidos contra la molécula LFA-1, AcMo no inductor de agregación anti VLA-4 (HP2/1) e IL-2. (G) Células LAK no agregadas en presencia de AcMos contra la molécula LFA-1, anticuerpo de isotipo similar como control inespecífico e IL-2.

Porcentajes de células NK frescas y células LAK adheridas a fibronectina (50  g/ml). La adhesión al plástico se utilizó como control positivo y la albúmina como control negativo. *Ensayos de inhibición utilizando los AcMos W6/32 (10  g/ml), P1D6 (10  g/ml) y HP2/1 (10  g/ml) y 20  g/ml de fragmentos peptídicos de FN CS1 y CS2. Esta unión fue bloqueada cuando las células se incubaron con el AcMo HP2/1 (anti  4 ) y el fragmento peptídico de la FN, CS1.

MOLÉCULAS DE ADHESIÓN ENDOTELIALES EN EL SCA Pacientes y grupos de estudios - 43 pacientes diagnosticados y tratados en el Instituto de Cardiología y Cirugía Cardiovascular de la Habana - 32 con IAM típico - 11 con AI - 37 sujetos sanos

Moléculas de Adhesion (ng/ml) Controles normales Angina inestableInfarto agudo de miocardio Admisión10 días despuésAdmisión10 días después VCAM   19.8*†24.4  13.2*†24.3  14.1**25.3  14.4** E- selectina 3.2   2.4*‡5.0  2.4*‡3.8  1.6‡3.2  1.1‡ ICAM     12.4***29.4  8.8*** Valores de las moléculas de adhesión endoteliales solubles en la angina inestable y el infarto agudo de miocardio al diagnóstico y 10 días después *p<0.05, **p<0.01,*** p<0.001, cuando ambos grupos de pacientes se compararon con los controles †p<0.05, cuando los pacientes con angina se compararon en el momento de la admisión y 10 días después ‡p<0.05, cuando ambos grupos de pacientes se compararon al momento de la admisión y 10 días después.

CIRCULACIÓN ENDOTELIO Flujo sanguíneo disminuido Respuesta inflamatoria   Evento isquémicoActivación endotelial activación de neutrófilos Liberación de E-Selectina Sobre-expresión de en la circulación E-selectina en las células endoteliales Incremento de IL-1  Mecanismo secuencial en el que se observa cómo una reacción de activación endotelial podría prolongar los altos valores de E-Selectina soluble en sangre en la Angina Inestable

MOLÉCULAS DE ADHESIÓN EN LA AD 38 pacientes adultos con el diagnóstico de AD atendidos en el Instituto de Hematología e Inmunología -38 pacientes adultos con el diagnóstico de AD atendidos en el Instituto de Hematología e Inmunología -20 en estado basal -18 con CVOD osteomioarticulares, abdominales y lumbares -20 individuos supuestamente sanos

** Expresión de las moléculas CD3, CD19 y CD57 en células mononucleares de controles normales, enfermos con anemia drepanocítica en estado basal y en crisis vasooclusiva dolorosa (CVOD) Diferencias significativas: p < 0.05 * Comparación entre controles y enfermos en estado basal ** Comparación entre controles y enfermos en CVOD *** Comparación entre ambos grupos de enfermos

* ** * *** * * * * ** *** Expresión de moléculas de adhesión en células mononucleares de controles normales, enfermos con anemia drepanocítica en estado basal y en crisis vasooclusiva dolorosa (CVOD) Diferencias significativas: p < 0.05 * Comparación entre controles y enfermos en estado basal ** Comparación entre controles y enfermos en CVOD *** Comparación entre ambos grupos de enfermos

* *** * ** *** * Expresión de moléculas de adhesión en neutrófilos de controles normales, enfermos con anemia drepanocítica en estado basal y en crisis vasooclusiva dolorosa (CVOD) Diferencias significativas: p < 0.05 * Comparación entre controles y enfermos en estado basal ** Comparación entre controles y enfermos en CVOD *** Comparación entre ambos grupos de enfermos

INFLAMACIÓN VASCULAR OCLUSIÓN VASCULAR Liberación de citocinas Interacción eritrocito/endotelio VLA-4/VCAM-1 CD36/trombospondina/CD36/VNR GPIIbIIIa/factor von Willebrand/VNR Activación endotelial Incremento de adhesión Plaquetas Leucocitos Eritrocitos    Activación de la coagulación Isquemia Formación de trombos Daño endotelial Vías funcionales de inflamación y oclusión vascular en la fisiopatogenia de la anemia drepanocítica.

Novedad de la investigación  Profundiza por primera vez en aspectos de la regulación funcional de las células NK en diferentes estados de activación, como la expresión de las moléculas  2 integrinas y VLA-4, el efecto de los AcMo específicos para estas moléculas como inductores de agregación celular, su acción sobre la proliferación y actividad citotóxica y la capacidad de estas células de adherirse a la matriz extracelular.  Se demuestran los mecanismos independientes de agregación homotípica de estas células mediados por LFA-1 y VLA-4 y la participación diferencial de las mismas en la actividad citotóxica de las células NK.

Novedad de la investigación  Se enriquece el conocimiento precedente sobre el vínculo entre niveles circulantes de las moléculas de adhesión y el daño isquémico miocárdico. En especial la evidencia del incremento de E-selectina en la AI durante los 10 primeros días tras el episodio agudo a diferencia del IAM, como posible marcador sindrómico, de potencial valor pronóstico y terapéutico.  En la AD se ofrece una nueva descripción integradora de las moléculas de adhesión que median la interacción leucocito/endotelio/eritrocito, identificándose diferencia entre la condición basal de la enfermedad y las CVOD lo que apoya el papel primario de los fenómenos derivados de la interacción intercelular en los eventos oclusivos e inflamatorios de esta patología

Publicaciones internacionales Macías C, Ballester JM, Campanero MR, López-Botet M, de Landázuri MO, Sánchez- Madrid F. Expression and functional activity of the VLA-4 molecule on human natural killer cells. Exp. Hematol 1995; 23: 917. Macías C, Ballester JM, Hernández P. Expression and functional activity of the very late activation antigen-4 molecule on human natural killer cells in different states of activation. Immunology 2000;100: Macías C, Villaescusa R, del Valle L, Boffil V, Cordero G, Hernández A, Hernández P, Ballester JM. Moléculas de adhesión endoteliales ICAM-1, VCAM-1 y E-selectina en pacientes con síndrome coronario agudo. Rev Esp Cardiol 2003;56: Macías C, del Valle L, Socarrás B, de León J, Badía T, Hernández P, Ballester JM. Expresion of adhesion molecules in sickle cell disease. Pediatric Blood and Cancer (en revisión).