La Pirazinamidasa (PZAsa) de Mycobacterium Tuberculosis : Aspectos Moleculares del Mecanismo de Resistencia BSc. Jun Sotelo Romero Unidad de Bioinformática y Biología Computacional LID-UPCH Laboratorio de Enfermedades Infecciosas LID-UPCH

Mycobacterium tuberculosis Agente etiológico de la Tuberculosis, la enfermedad infecciosa que más muertes provoca en el mundo. La Tuberculosis es un complejo de fenómenos microbiológicos e inmunológicos que escapa a una definición simple. Nuevos Problemas: Asociación con la infección del virus del VIH. Resistencia a la acción de los fármacos. El Mycobacterium tuberculosis es capaz de causar tanto un proceso agudo de enfermedad como una infección latente asintomática. Un tercio de la población mundial puede estar infectada con el bacilo en este estado.

Tuberculosis mata a 2 persona en el mundo cada 15 segundos

Problemática de la Tuberculosis Reemergencia. Asociación a HIV. 2/3 personas infectadas con TB. GLOBAL Países Industrializados Problema endémico Asociado a “pobreza”, desnutrición, drogadicción y otras enfermedades. Concentrado en “bolsones”. 90% TB del Perú → Lima. NACIONAL Países en Desarrollo

Transmisión de la TB Vía aérea ( partículas suspendidas en el aire ). Existe alta transmisión de TB en el grupo de 15-20 años. Existen factores que predisponen la manifestación clínica de la enfermedad. En el 3, eso quiere decir que por motivos geneticos unos presentan mayor sintomatica que otros?

Infección en los alvéolos Los bacilos se multiplican y se movilizan hacia los ganglios linfáticos traqueobronquiales Hipersensibilidad de tipo retardado e inmunidad mediada por células Positividad con la tuberculina Se contiene la enfermedad Las bacterias viven pero no se multiplican De estos 91% sin enfermedad 6% TBC Clínica - 2% Pulmonar - 3% extratorácica - 1% ambos casos 3% Enfermedad sistémica progresiva y Muerte. Poca o ninguna hipersensibilidad. Negátividad con la tuberculina Enfermedad sístemica progresiva y Muerte Forma clínica de la TB. Qué es inmunidad mediad por células? En la latencia, lo s 3 cuadros de abajo es cuando se rompe la latencia y se produce la enfermedad debido a una baja de las defensas? Qué es la tuberculina? LATENCIA

Vacunas para TB BCG (La vacuna de bacilo de Calmette-Guérin ). No existe vacuna efectiva contra TB. BCG (La vacuna de bacilo de Calmette-Guérin ). ● No protege para la TB pulmonar. ● Si protege para TB meningea - Muy rara. - Necesario si se trata de una zona endémica. BCG que shusha significa

Diagnóstico de TB No existen pruebas serológicas (ELISA, Western Blot ). En general, no existen pruebas tradicionales rápidas. Método convencional → “cultivo” 2-3 meses ( para conocer la susceptibilidad a las drogas ). MAYOR PROBLEMA : Dar el tratamiento específico para cada paciente. Que es Western Blot

Tratamiento de TB Un gran problema es el incremento de la TB MDR. Drogas de 1° Línea. Un gran problema es el incremento de la TB MDR. Una DROGA MUY IMPORTANTE→Pirazinamida - Única droga que mata al Myc. Tub. en estado latente. - Tratamiento estándar + PZA → Mejores resultados. Rifampicina Isoniazida Las más efectivas y con menos efectos laterales pero ↑ RESISTENCIA TB MDR es resistente al menos a Rifampicina e Isoniazida. Buscar la diapositiva de la clase de Mirko., en donde salen las drogas y los tratamientos estandarizados y esas vainas.

El problema de la Tuberculosis multidrogo resistente en el Perú Estimados de niveles de resistencia a drogas en pacientes que ingresan al esquema de tratamiento Estandarizado (1997-2003) Etionamida (E) 40% Etambutol (Et) 45% Pirazinamida (Z) 30% Ciprofloxacina (C) 4% Kanamicina (K) 3% Datos de la Unidad Técnica TBMDR- MINSA

Estructura de la Pirazinamida (PZA) y sus análogos

Hidrólisis de la PZA por parte de la enzima Pirazinamidasa PZAase

Mecanismo antibacteriano de la PZA CAUSAS DE RESISTENCIA : Falla funcional de la PZAase. Falla del sistema de flujo/eflujo. Falla del ingreso de la PZA. Mutaciones en el promotor??? Por eso que se tiene que estudiar a la PZAase.

J Bacteriol. 2000 Jul;182(13):3881-4.Related Articles, Links     Mycobacterium smegmatis has two pyrazinamidase enzymes, PncA and pzaA. Guo M, Sun Z, Zhang Y. Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Hygiene and Public Health, Johns Hopkins University, Baltimore, Maryland 21205, USA. The Mycobacterium smegmatis pncA gene, encoding nicotinamidase/pyrazinamidase, was identified. While it was similar to counterparts from other mycobacteria, the M. smegmatis PncA had little homology to the other M. smegmatis pyrazinamidase/nicotinamidase, encoded by the pzaA gene. Transformation of Mycobacterium bovis strain BCG with M. smegmatis pncA or pzaA conferred susceptibility to pyrazinamide. PMID: 10851013 [PubMed - indexed for MEDLINE]

Identification, cloning, and expression of the Escherichia coli pyrazinamidase and nicotinamidase gene, pncA. Frothingham R, Meeker-O'Connell WA, Talbot EA, George JW, Kreuzer KN. Infectious Diseases Section, Durham Veterans Affairs Medical Center, North Carolina 27705, USA. rfr@galactose.mc.duke.edu Pyrazinamide (PZA) is one of the three most important drugs for treatment of Mycobacterium tuberculosis infections. The antibacterial activity of PZA requires a bacterial enzyme, pyrazinamidase (PZAase), which hydrolyzes PZA to form pyrazinoic acid and ammonia. Most PZA-resistant clinical M. tuberculosis isolates lack PZAase activity. With the goal of eventually identifying and characterizing the M.tuberculosis PZAase gene, we began with the more tractable organism, Escherichia coli, which also has PZAase activity. We screened a transposon-generated E. coli insertion mutant library, using a qualitative PZAase assay. Two PZAase-negative mutants out of 4,000 colonies screened were identified. In each mutant, the transposon interrupted the same 639-bp open reading frame (ORF), ORF1. The expression of ORF1 on a multicopy plasmid complemented a PZAase-negative mutant, leading to PZAase activity levels approximately 10-fold greater than those of the wild type. PZA has a structure similar to that of nicotinamide, a pyridine nucleotide cycle intermediate, so we tested our strains for nicotinamidase activity (EC 3.5.1.19) (genetic locus pncA). The construct with multiple plasmid copies of ORF1 had an approximately 10-fold increase in levels of nicotinamidase activity. This overexpressing strain could utilize nicotinamide as a sole nitrogen source, through wild-type E. coli cannot. We conclude that a single E. coli enzyme accounts for both PZAase and nicotinamidase activities and that ORF1 is the E.coli PZAase and nicotinamidase gene, pncA.

Publicación del genóma de Mycobacterium tuberculosis : Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. S. T. Cole, y Col Nature 393, 537-544 (1998).

Secuencias de ADN y aminoácidos de la PZAaseTB cepa H37rv gi|1706963|gb|U59967.1|MTU59967 1 atgcgggcgt tgatcatcgt cgacgtgcag aacgacttct gcgagggtgg ctcgctggcg 61 gtaaccggtg gcgccgcgct ggcccgcgcc atcagcgact acctggccga agcggcggac 121 taccatcacg tcgtggcaac caaggacttc cacatcgacc cgggtgacca cttctccggc 181 acaccggact attcctcgtc gtggccaccg cattgcgtca gcggtactcc cggcgcggac 241 ttccatccca gtctggacac gtcggcaatc gaggcggtgt tctacaaggg tgcctacacc 301 ggagcgtaca gcggcttcga aggagtcgac gagaacggca cgccactgct gaattggctg 361 cggcaacgcg gcgtcgatga ggtcgatgtg gtcggtattg ccaccgatca ttgtgtgcgc 421 cagacggccg aggacgcggt acgcaatggc ttggccacca gggtgctggt ggacctgaca 481 gcgggtgtgt cggccgatac caccgtcgcc gcgctggagg agatgcgcac cgccagcgtc 541 gagttggttt gcagctcctg a MRALIIVDVQNDFCEGGSLAVTGGAALARAISDYLAEAADYHHV VATKDFHIDPGDHFSGTPDYSSSWPPHCVSGTPGADFHPSLDTS AIEAVFYKGAYTGAYSGFEGVDENGTPLLNWLRQRGVDEVDVVG IATDHCVRQTAEDAVRNGLATRVLVDLTAGVSADTTVAALEEMR TASVELVCSS

El alineamiento múltiple de aprox El alineamiento múltiple de aprox. 120 genes de PZAase secuenciados a partir de cepas “peruanas” sensibles y resistentes muestran una alta conservación de la región promotora TATA Box Start codon Región promotora

Distribución de mutaciones ‘únicas’ halladas en el gen de PZAsa

Clonación y Purificación de PZAase H37RV y mutantes Expresar el gen recombinante en E. coli. La clonación adiciona 6 His al extremo COO- de la enzima. La purificación se realiza mediante Cromatografia de Afinidad por Columna de Níquel. Las His terminales se enlazan al Niquel. Luego se realiza un lavado con solución de imidazol. Esta bien lo que escribo? Uso las palabras adecuadas?

Purificación de la enzima PZAsa

Parámetros cinéticos y la actividad enzimática de PZAsas mutantes Búsqueda de una explicación a nivel : Estructura-Función !!!

Análisis Estructural y Creación del Modelo No existen cristales de PZAase de Mycobacterium tuberculosis. Se modelaron las estructuras utilizando el expassy server. Buena homologia (37%). - PZAase de Mycobacterium tuberculosis - PZAase de Pyrococcus horikoshi (pdb 1IM5 ) Disposicion espacial del backbone aceptable (prochek).

PZAase de Pirococcus horikoshii pdb 1IM5

Debido a la analogía entre la PZAase de Pyrococcus horikoshii (PH999) y la de Mycobacterium tuberculosis; PH999 brinda las bases estructurales para entender la resistencia a la PZA en Mycobacterium tuberculosis ocasionada por mutaciones de PZAase.

Sitio Activo de la PZAase de Pirococcus horikoshii Metaloenzima de Zinc N.C. 6 (2His, 1Asp,3H2O)

Anillo catalítico de la PZAsa de pyrococcus hirokoshii (Ala129, Cys133, Lys94, Asp10)

Mecanismo de Acción propuesto en PZAase de Pirococcus horikoshii Sitio activo “Anclaje” de la PZA

C133→D10 Transferencia protónica 1). Rxn C133→PZA 1° ataque nucleofílico

C de PZA sp2→sp3. O de PZA sp2→sp3 PZA unido covalentemente a PZAase.

D10 : protona a NH2 de PZA. 2). Rxn Se libera NH3. O de PZA sp3→sp2

C de PZA sp2→sp3. O de PZA sp2→sp3 3). Rxn ZNOH→PZA 2° ataque nucleofílico C de PZA sp2→sp3. O de PZA sp2→sp3

N.C. Zn de 6→5

4). Rxn H2O del medio N.C. Zn de 5→6 Protonación de D10

5). Rxn C-S de PZA desprotona D10 O de PZA sp2→sp3

Se libera ácido pirazinoico. Se regenera la enzima

En resumen :

Dinámica Molecular por “Manual Bonding” - César Lopez & Mirko Zimic Las reacciones químicas no ocurren a 2D. Ocurren en 3D. Se debe estudiar el mecanismo de reacción tridimensionalmente. “ En tiempo real ”. La Dinámica molecular nos permite estudiar un proceso físico-químico en tiempo real siempre y cuando no se formen o rompan enlaces químicos (tratamiento cuánticos muy costosos).

Dinámica Molecular por “Manual Bonding” - GROMACS Propuesta : Realizar Dinámica Molecular a cada etapa de la reacción química. Cuando estemos ante una “inminente” formación o ruptura de enlace químico detenemos la dinámica. Distancias interatómicas Ángulos interatómicos. Energías de activación Formamos el nuevo enlace “manualmente” y continuamos con la dinámica molecular.

Dinámica Molecular por “Manual Bonding” - GROMACS La PZA se “dockeo” a la PZAase empleando el software AUTODOCK.

Localizacion de la Pyrazinamida en el sitio activo

Dinámica Molecular por “Manual Bonding” Dinámica Molecular por “Manual Bonding”. Hidrólisis de PZA en PZAase PH999

Sitio activo

Resultados La PZA interacciona mediante puentes hidrógenos adicionales, no descritos por Du. Parametrizarla en H2O. La PZA se estabiliza por interacciones -stacking. Se corrobora el mecanismo general propuesto por Du, en la medida que cada una de las etapas de las reacciones se muestran favorecidas por medio de distancias, orientaciones y energías que se dan luego de los pasos de DM.

Resultados La PZAsa sufre cambios conformacionales (reversibles y prevalentes en ciertas zonas: alfa helice entre el loop y el sitio de coordinación del zinc). Congruencia de la predicción de Autodock con las predicciones de DM de gromacs (la DM no 'mueve' mucho a la PZA del sitio que lo dejo Autodock).

Aplicaciones del “Manual Bonding” En el caso de enzimas mutantes con actividad nula confirmada experimentalmente, se puede identificar el punto exacto en el que el camino de hidrólisis se bloquea, provocando la falta de hidrólisis de la PZA.

Influencia del Zn en la estructura de PZAase de Pyrococcus horikoshii RMSD de la enzima y de la apoenzima muy cercanos. Aumenta el valor del factor B. Da mayor estabilidad (disminuye el grado de movimiento). D52 y H71 prácticamente no varían. ¡ H54 gira 180° !, de manera que se alcanza una estabilidad electrostática (rotámeros). Se produce un acercamiento entre estos 3 Aa. Pegar una foto del alineamiento estructural bien BACAN

Obtención del Modelo de PZAase de Mycobacterium Tuberculosis cepa h37rv Modelamiento por homología empleando la PZAase de Pyrococcus horikoshii. SwissModel server. Refinamiento estructural mediante Dinámica Molecular. Cluster Linux - TcpLINDA de 24 PCs (aula interactiva) Publicación Protein Data Bank : 1X8A. Insight II (Accelerys Inc.) Gaussian03 (Gaussian.com) Gromos96 (BIOMOS) Gromacs (H.Berendsen’s group) Qu

Modelo de PZAase H37RV

PZAase PH999

H37RV v.s. PH999

Alineamiento Estructural de Pirazinamidasas PZAsa Pyrococus Horikoshi H37rv

Comparación del Sitio Activo

Influencia del Zn en la estructura de PZAase de Pyrococcus horikoshii Zn presenta un rol CATALÍTICO, no estructural; es decir no modifica en gran medida la estructura de la PZAase. Pegar una foto del alineamiento estructural de la enzima y de la apoenzima bien BACAN

Medidas enzimáticas de PZAase H37RV Prueba de Wayne Sulfato de amonio ferroso 1% Incubar a 37°C PZAase PZA Buffer Detener la Rxn: Buffer GLy/HCl OD 450nm

Reducción de la actividad de la PZAase H37RV por el efecto de una quelación con EDTA SERIA MEJOR ADJUNTAR LAS DE PATY FERRER; por que estas son las de Cesar. Pero para los fines, creo que da igual. EDTA, 6horas, pH=8

Quelación de la PZAase H37RV EDTA, 6horas, pH=6.45

EL EDTA disminuye la actividad. → Muy probablemente ocurre la quelación de la metaloenzima. Un ion metálico es importante en el mecanismo de acción de la PZAase H37RV. Cuál???

Reactivación de la PZAsa H37RV quelada mediante de la adición de iones

No necesariamente el ion que mejor activa es el que se encuentra en la proteína (p.Ejem. Co+2 y Zn+2). Se relaciona con la abundancia del elemento en la naturaleza. Se necesitan pruebas experimentales más directas : - Absorción Atómica (UNI) - Fluoresencia de Rayos X (IPEN)

Determinación de Zinc en PZAase H37R por Espectroscopía de Absorción Atómica Quim. Cristhian Jacinto. Dpto. Qúimica, UNI Equipo : Perkin Elmer Precisely Aanalyst 200 Atomic Absorption Spectrometer. Lámpara de Zinc. Método de Adición Estándar

Determinación de Zinc en PZAase H37R por Espectroscopía de Absorción Atómica Estos métodos se basan en la obtención de espectros de emisión de la muestra ‘atomizada’ mediante la excitación de arcos eléctricos o chispas eléctricas. Estos espectros permiten la determinación cuantitativa de elementos metálicos. En las fuentes de arco y chispa la excitación de la muestra se produce en el pequeño espacio existente en un par de electrodos.

Determinación de Zinc en PZAase H37R por Espectroscopía de Absorción Atómica No se detecto Zinc.

Determinación Metálica en PZAase H37R por Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X Fís. Dr. José Solis (UNI-IPEN) Equipo : EPSILON5 de Panalytical Excitación por R-X de los electrones internos y su posterior decaimiento El espectro fluorescente de decaimiento es característico para cada átomo Es un análisis NO-destructivo Adjuntar una foto del equipo de Fluorescencia.

Determinación Metálica en PZAase H37R por Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 1 foto y funfamento teórico Este método se basa en la excitación de los electrones más internos por medio de Rayos X. El decaimiento de estos electrones obedece a un proceso de fluorescencia generando un patrón único y típico de cada átomo.

Determinación Metálica en PZAase H37R por Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X Una foto del espectro y los resultados. RESULTADO GLOBAL : Nos la jugamos? Metaloenzima de Fe+3? Se detecto Ni+2, Fe+3 y Pb+2.

CONCLUSIÓN GENERAL : El Co reactiva en 1° lugar; 2° el Zn; y 3° el Fe+3. Medio de Expresión : E. Coli

Química Bioinorgáncia Es el estudio de los sistemas inorgánicos en los seres vivos. Debemos entender por sistemas inorgánicos a todos los elementos y compuestos que habitualmente son parte del estudio de la química inorgánica. Enfasis en Metaloenzimas (Hemoglobina Fe; Clorofila Mg; Vitamina 12 Co

Interacción de Iones Metálicos con Proteínas Interacciones tienen lugar en sitios específicos de las cadenas proteicas (restos de aminoácidos). Algunas veces el O del anillo peptídico ( grupo amida ) refuerza la coordinación. Los ligantes más frecuentes son los grupos: Imidazol (His, H) Tiolato (Cys, C) Carboxilato (Glu G, Asp A) Tioéter Met, M) Fenolato (Tyr, Y)

Interacción de Iones Metálicos con Proteínas La esfera de coordinación que las proteínas generan alrededor del ión metálico, presenta geometría irregular. Diferente a los ligantes monodentados, el ión metálico no puede organizar a su alrededor la esfera de coordinación, tiene que adaptarse al entorno que le ofrece la proteína. La propia estructura de la proteína determina el número y la orientación espacial de los grupos dadores que pueden unirse al metal. Rol Catalítico.

Cys-M Cys-M2 His-M

*Se forman estruturas semejantes con el Glu Asp-M (monodentado) (puente,quelante) (puente,bidentado) *Se forman estruturas semejantes con el Glu

Met-Me Tyr-M

Base de Datos Metalo-Proteínas

Residuos coordinantes 2 ó 3 Nótese el patrón No 1 Asp – His – His = 19

Residuos coordinantes 2 ó 3 Ahora nótese el patrón No 3 Asp – His = 28 ocurrencias

Distancias de coordinación

Distancias de coordinación

Interacción de Iones Metálicos con Proteínas →→Si se cuenta con la estructura de una apoenzima se puede predecir mediante criterios geométricos cuántos potenciales sitios de coordinación presentaría. Script en PERL. Carboxipeptidasa Zn; Anhidrasa carbónica Zn; Plastocianina Cu; etc. Metaloenzimas mononucleares, en donde el ion es el único cofactor. Aplicaremos lo anterior a nuestro modelo de PZAase H37RV.

Fotos de los 2 probables sitios de coordinación

PZAas H37RV presenta 2 potenciales sitios de coordinación : HIS51 (ND1), HIS71( NE2), TYR64(OH), ASP49 ( OD1 y O ). TYR41(OH), HIS43(ND1), ASP86 (OD1), SER88(OG). No me acuerdo, se los paso lo más antes posible.

Cristalización de PZAase En UPCH estudiamos las condiciones de precristalización. En “Hampton-Woodward” Medical Institute, University of Buffalo NY. USA. (Dr. Willliam Duax) automatizadamente se estudiaron 1536 condiciones distintas de cristalización. Se obtuvieron fotos de crecimiento de microcristales. Es probable que el cristal difracte rayos x

http://www.hwi.buffalo.edu/ El crecimiento de cristales se realizará en UPCH El análisis de difracción se planea realizar en las facilides de Radiación Sincrotrón en Campinas, Sao Paulo, Brazil. Adjuntar una foto bacan de Buffallo

Buffer de control 4 semanas PZAase 1semana

PZAase 2 semanas PZAase 3semana

Futuros trabajos Mejorar el modelo de la PZAase H37RV. ( Ion ). Cristalizar PZAase H37RV y obtener su estructura. Proponer un mecanismo de reacción y contrastarlo con DM por “Manual Bonding” a PZAase H37RV. Estudiar por qué PZAases de ciertas cepas resistentes son NO-funcionales Estandarizar y validar la determinación del contenido metálico en potenciales metaloenzimas mediante Fluorescencia de rayos X.

Futuros trabajos Reactivar a la cepa mutante D49N. Cepa muy importante por su alta prevalencia en la población peruana TB-VIH. OBJETIVO GLOBAL : Mejorar la PZA. Es una prodroga. G crítico ni muy alto (+) ni muy bajo (-). Problema estructural a nivel atómico.

Miembros del Equipo Laboratorio de Bioinformática: César López Wilfredo Evangelista Jun Sotelo Daniel Guerra Mirko Zimic Laboratorio de Enfermedades Infecciosas: Patricia Ferrer Jon López Patricia Sheen