Tema propuesto: Identificación de genes potenciales relacionados con el eflujo de membrana de Mycobacterium tuberculosis utilizando herramientas bioinformáticas.

Presentación del tema: "Tema propuesto: Identificación de genes potenciales relacionados con el eflujo de membrana de Mycobacterium tuberculosis utilizando herramientas bioinformáticas."— Transcripción de la presentación:

1 Tema propuesto: Identificación de genes potenciales relacionados con el eflujo de membrana de Mycobacterium tuberculosis utilizando herramientas bioinformáticas Título del Proyecto: Identificación de genes homólogos a EmrB (de Escherichia coli) como genes potenciales relacionados con el flujo de salida de Ácido Pirazinóico en Micobacterium tuberculosis

2 Introducción Introducción Taxonomía
Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium. Descripción: aerobio obligado, no móvil, bacilo respomsable de tuberculosis. Número de membranas: 1 Presencia de flagelo: No Interacción: Patógeno animal en Mamíferos

3 Introducción PZA Pirazinamida Nicotinamida

4 PZA Introducción Resistencia: mutaciones en PZasa
Monica Pajuelo Travezaño: Prodroga Enzima PZAsa Introducción PZA PZasa + H2O + NH4+ Resistencia: mutaciones en PZasa Resistencia: sin mutaciones y con actividad intacta

5 1. Mecanismo de acción de la PZA
Antecedentes 1. Mecanismo de acción de la PZA

6 2. Resistencia a la PZA Antecedentes Mutación en PZasa
¿Bombas de flujo de salida involucradas? M. smegmatis: Tiene dos PZasas activas Frente a inhibidores de transportadores: reserpina, valinomicina, las cepas se hacen sensibles

7 Antecedentes 2. Resistencia a la PZA

8 3. Sistemas de flujo de salida de POA en M. tuberculosis
Antecedentes 3. Sistemas de flujo de salida de POA en M. tuberculosis No hay estudios Schaller (2002) encontró EmrB y la proteína del mismo nombre que al mutar EmrB, E. coli se hacía ligeramente más resistente a POA Familia Major Facilitator Superfamily

9 Objetivos Objetivos Identificar genes homólogos a EmrB de E. coli relacionados con el flujo de salida de ácidos orgánicos débiles o de drogas en M. tuberculosis Verificar que los posibles genes contribuyan con el flujo de salida de POA en M. tuberculosis

10 Planteamiento del Experimento
Uso de COG Búsqueda de genes homólogos a Emrb de E. coli Búsqueda en TubercuList Predicción de Segmentos Transmembrana Uso de TMpred Resultados Preliminares

11 Planteamiento del Experimento
Recombinación genética homóloga Knockout de genes Acumulación de POA Uso de sustrato radiactivo marcado con C14 Determinación de la sensibilidad a PZA/POA Determinación de MIC Determinación de la actividad de PZasa Método de Wayne

12 Planteamiento del Experimento

13 Planteamiento del Experimento

14 Planteamiento del Experimento

15 Planteamiento del Experimento

16 Planteamiento del Experimento

17 Planteamiento del Experimento

18 Planteamiento del Experimento

19 Planteamiento del Experimento

20 Búsqueda de genes homólogos a EmrB
Planteamiento del Experimento Búsqueda de genes homólogos a EmrB Genes: M. tuberculosis: Rv1250 Rv1634 Rv2846c Rv0783c M. smegmatis: En el ORF finder del NCBI (515aa) contig:3563:m_smegmatis (from to )

21 Motivo A: GRLADRFGRRRVLL
Planteamiento del Experimento Motivo A: GRLADRFGRRRVLL

22 Planteamiento del Experimento

23 Planteamiento del Experimento

24 Knockout de los genes Planteamiento del Experimento Diseño de primers
Res kana SacB Clonamiento en vector bomba Otros genes Recombinación Recombinación homóloga Recombinación no homóloga

25 Knockout de los genes Planteamiento del Experimento
Células no recombinanates Recombinación no homóloga Recombinación homóloga Tratamiento con kanamicina Crecimiento en sucrosa

26 Acumulación de POA intracelular
Planteamiento del Experimento Acumulación de POA intracelular Justificación: Verificar si el knockout del gen incrementa la acumulación de POA intracelular. Método: Marcaje con carbono radiactivo Principio:La acumulación de POA intracelular

27 Acumulación de POA intracelular
Planteamiento del Experimento Acumulación de POA intracelular (14C)POA 1mCi/mL Incubar a 37°C hasta 24h Susp. de células Alícuotas de 50L / 30min Contador de Centelleo Filtrar al vacío

28 Planteamiento del Experimento
Determinación de MIC Diluciones de PZA

29 Actividad PZasa Planteamiento del Experimento
Justificación: Para comprobar que la enzima PZasa esté activa, si es que se tuviera una menor susceptibilidad a PZA. Método: Wayne Principio: Se detecta POA como producto de la acción de PZasa sobre PZA. El POA reacciona con sulfato de amonio ferroso, produciendo una coloración rosada.

30 Actividad PZasa Planteamiento del Experimento
Sulfato de amonio ferroso 1% Incubar a 37°C por 4 días Dejar x 30min a T° ambiente Inocular el tubo

31 Planteamiento del Experimento