Estudio del mecanismo de la pirazinamidasa de Mycobacterium tuberculosis. Mecanismo de resistencia a la pirazinamida. Jon López-Llano, Ph. D. Laboratorios.

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1 Estudio del mecanismo de la pirazinamidasa de Mycobacterium tuberculosis. Mecanismo de resistencia a la pirazinamida. Jon López-Llano, Ph. D. Laboratorios de Investigación y Desarrollo, UPCH

2 INTRODUCCIÓN La tuberculosis causa casi 2 millones de muertes al año.
La tuberculosis tiene cura pero aun así mata a 5000 personas al día. El 98% de las muertes por TB se producen en países en vías de desarrollo y corresponden en su mayoría a adultos jóvenes en los años más productivos. La tuberculosis en la principal causa de muerte en las personas infectadas por el VIH. Si no se controla, la tuberculosis matara otros 35 millones de personas en los próximos 20 años. 2 mil millones de personas, es decir, una tercera parte de la población mundial, están infectadas por el bacilo tuberculoso. La MDR-TB está presente en casi todos los 109 países estudiados recientemente por la OMS/WHO y sus asociados. Cada año surgen casos nuevos de MDR-TB. WHO 2005

3 INTRODUCCIÓN

4 INTRODUCCIÓN

5 El problema de MDR-TB en Perú
Niveles de resistencia de diferentes drogas en pacientes con tratamiento estandar en el Perú ( ) Etionamida (E) 40% Etambutol (Et) 45% Pirazinamida (PZA) 30% Ciprofloxacino (C) 4% Kanamicina (K) 3% Unidad Técnica TBMDR- MINSA -2003

6 Importancia de la PZA en el tratamiento de TB
Capaz de eliminar bacilos de Mycobaterium tuberculosis en estado latente (efectividad del 95%). Su uso acorta el tratamiento de 9 a 6 meses.

7 Mecanismo antibacteriano de la PZA
Causas de resistencia a PZA: Mal funcionamiento de la PZasa (80-99%) Fallas sistema flujo/eflujo Falta de toma de PZA Expresión inadecuada de PZasa Por eso que se tiene que estudiar a la PZAase.

8 Hidrólisis de la Pirazinamida
Nicotinamidasa/Pirazinamidasa

9

10 Estructura tridimensional de la Pirazinamidasa

11 Estructura 3D de la PZasa
P. Horikoshii Pzasa con homología de secuencia 37% Otro modelo a partir de N-carbamoylsarcosine amidohydrolase (CSHasa) de Arthrobacter sp., de parecida función y homolgía 26%

12 Estructura 3D de la PZasa
P. Horikoshii M. tuberculosis

13 Estructura 3D de la PZasa

14 Estructura 3D de la PZasa
M. tuberculosis H51 H71 D49 D8 A134 C138 Sitio unión metal D49 H51 H71 Sitio activo D8 A134 C138

15 Hidrólisis de la Pirazinamida

16 Distribución de mutaciones missense en PZasa en cepas aisladas en el Perú

17 Distribución de mutaciones missense en PZasa en cepas aisladas en el resto del mundo
363 mutaciones diferentes reportadas a nivel del gen

18 Clonación y Purificación de PZasa H37RV (y mutantes)
Esta bien lo que escribo? Uso las palabras adecuadas?

19 Clonamiento de la PZasa
ATGCGGGCGTTGATCATCGTCGACGTGCAGAACGACTTCTGCGAGGGTGGCTCGCTGGCGGTAACCGGTGGCGCCGCGCTGGCCCGCGCCATCAGCGACTACCTGGCCGAAGCGGCGGACTACCATCACGTCGTGGCAACCAAGGACTTCCACATCGACCCGGGTGACCACTTCTCCGGCACACCGGACTATTCCTCGTCGTGGCCACCGCATTGCGTCAGCGGTACTCCCGGCGCGGACTTCCATCCCAGTCTGGACACGTCGGCAATCGAGGCGGTGTTCTACAAGGGTGCCTACACCGGAGCGTACAGCGGCTTCGAAGGAGTCGACGAGAACGGCACGCCACTGCTGAATTGGCTGCGGCAACGCGGCGTCGATGAGGTCGATGTGGTCGGTATTGCCACCGATCATTGTGTGCGCCAGACGGCCGAGGACGCGGTACGCAATGGCTTGGCCACCAGGGTGCTGGTGGACCTGACAGCGGGTGTGTCGGCCGATACCACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCGCCAGCGTCGAGTTGGTTTGCAGCTCCTGA S. T. Cole et. al., Nature (1998).

20 Purificación de la PZasa
Movie

21 Purificación de la PZasa

22 Relación entre la eficiencia de la PZasa y la resistencia microbiológica (MIC, Wayne) de M. tuberculosis

23 Parámetros cinéticos de la PZasa
Cinética Michaelis-Menten Vmax [S] V0 = Km +[S]

24 Parámetros cinéticos de la PZasa
H37Rv D12A D12G G24D Y34D K48T D49N H51R G78C F94L T135P D136G

25 Parámetros cinéticos de la PZasa

26 Método Wayne Cálculo MIC
Ensayo de actividad pirazinamidasa in vivo Concentración mínima inhibitoria Métodos BACTEC Lowenstein-Jensen Middlebrook 7HX

27 Parámetros cinéticos de la PZasa

28 Obtención de la estructura tridimensional de la PZasa

29 Cristalización de la PZasa
Gota colgante

30 Cristalización de la PZasa
Buffer control 4ª semana PZAsa 1ª semana PZAsa 2ª semana PZAsa 3ª semana Exploración de las condiciones óptimas de cristalización (1536 condiciones) “Hampton-Woodward” Medical Institute, University of Buffalo NY. USA. (Dr. Willliam Duax)

31 Cristalización de la PZasa

32 Trabajo pendiente Mejorar el modelo de la PZasa H37Rv.
Optimizar la producción de cristales y obtener la estructura 3D de la PZasa H37Rv (y mutantes). Determinar el contenido metálico del enzima mediante Fluorescencia de rayos X. Estudiar el efecto de diferentes metales en la actividad de la PZasa, en la proteína quelada y sin quelar. Determinar el efecto de las mutaciones a nivel molecular y proponer un mecanismo de reacción para la hidrólisis de la PZA. Obtener anticuerpos monoclonales anti-PZasa para su posible uso como diagnóstico.

33 Laboratorio de Bioinformática Laboratorio de Enfermedades Infecciosas
Miembros del Equipo Laboratorio de Bioinformática Wilfredo Evangelista Daniel Rueda Mirko Zimic Laboratorio de Enfermedades Infecciosas Patricia Ferrer Gina Christiansen Jon López-Llano Patricia Sheen