Introducción a las variables involucradas en la cuantificación de ARN por la técnica de la RT-qPCR Luis Veggi Diseño, ejecución y reporte de experimentos de retrotranscripción seguida de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)

La qPCR, cuantificando la intensidad de fluorescencia Seguir la cinética de una reacción química midiendo la cantidad de producto

El output de la qPCR: el perfil cinético de la reacción PCR la curva sigmoidea de amplificación

Los pasos de la reacción de la polimerasa

La qPCR: el termociclador

La reacción en cadena Ecuación Nro. moléculas =2n

Las fases del perfil cinético de amplificación

La cuantificación se realiza en base al ajuste sobre la fase de crecimiento exponencial de la ecuación Qn ciclos = Qini x 2n ciclos Ecuación Nro. moléculas =2n

Grafico de cinética de amplificación Log Qn ciclos = log Qini + log 2 x n ciclos Qn ciclos = Qini x 2n ciclos Identifico la zona de crecimiento exponencial por la observación una zona recta con la duplicación de un valor cte de punto a punto, si hay varias muestras las curvas deben ser paralelas intensidad fluorescencia vs nro ciclo log intensidad fluorescencia vs nro ciclo

La eficiencia de la amplificación Qn ciclos = Qini x 2n ciclos Eficiencia en % =100 % ??? Qn ciclos = Qini x (Ef)n ciclos

Cq el valor de referencia para cuantificar la cantidad inicial QCq = Qini x (Ef)Cq valor arbitrario

Grafico de cinética de amplificación QCq = Qini x (Ef)Cq Log QCq = log Qini + log (Ef) x Cq Línea de cuantificación Cq Cq Línea de cuantificación intensidad fluorescencia vs nro ciclo log intensidad fluorescencia vs nro ciclo

Como realizo la cuantificación de la cantidad inicial de ADN de un gen de interés (GOI)? Muestra 1 QCq1 = Qini1 x (Ef)Cq1 Qini1 = QCq1 / (Ef)Cq1 En esta ecuación Cq1 lo obtengo del resultado de la medición de la muestra, la eficiencia lo obtengo de la curva estándar, entonces necesito el valor de QCq1.

Cuantificación absoluta Cuantificación relativa Cual es la diferencia de hacer una cuantificación relativa o una cuantificación absoluta? La diferencia esta en la estrategia que se utiliza para superar la situación de desconocer el valor de cantidad ADN en el sitio de cruce de la curve de amplificación y la línea de cuantificación. Cuantificación absoluta Se obtienen valores de la cantidad absoluta (numero de copias, mg etc) en base una curva de calibración que permite obtener el valor de la cantidad de ADN en la línea de cuantificación Cuantificación relativa Los valores de concentración se obtienen dándole un valor arbitrario al valor QCq a todos los valores de las muestras que fueron procesadas y medidas en las mismas condiciones y con una misma línea de base y de cuantificación.

Cuantificación absoluta Cuantificación Relativa Para la muestra 1, muestra 2, muestra 3, muestra 4, etc. QCq1 = QCq2 = QCq3 = QCq4 = QCqn Qini1 x (Ef)Cq1 = Qini2 x (Ef)Cq2 = Qini3 x (Ef)Cq3 = Qini4 x (Ef)Cq4 Calibrador (estándar calibrador) es la muestra que se utiliza para superar esta situación Qini1 x (Ef)Cq1 = Qini2 x (Ef)Cq2 = Qini3 x (Ef)Cq3 = Qini4 x (Ef)Cq4 = Qinical x (Ef)Cqcal Cuantificación absoluta Cuantificación Relativa Muestra sobre la cual se relacionan (dividen o relativizan) todas las muestras Muestra de cantidad conocida del gen que permite dar un valor a QCqcal

Transformación logarítmica Cuantificación absoluta del gen de interés (GOI) Curva de calibración QCq = Qini x (Ef)Cq QCq = constante Transformación logarítmica Log Qcq = Log Qini + Log(Ef) x Cq Cq = (Log Qcq /(Ef)) – (1/(Log(Ef)) Log Qini (Ef)= 10-1/pte

Cuantificación absoluta Condiciones que debe tener una curva de calibración para ser utilizada con una determinada muestra Variación aleatoria del instrumento PCR block, lámpara, filtro, detector, etc). Variación en el seteo del análisis de resultados, corrección de la línea de base y la línea de cuantificación, reactivos (polimerasa, fluoróforos etc) y propiedades ópticas de los plásticos Condiciones Misma línea de base y de cuantificación Misma corrida de qPCR Mismo lote de RT Presencia de inhibidores, implica mismo procedimiento extracción, mismo tipo de muestra Los calibradores tienen que ser muestras muy similares a las de estudio En general se mide en la misma corrida que la misma muestra QCqcal = Qinical x (Ef)Cq1 QCqcal = QCq1 Qini1 = QCq1 / (Ef)Cq1

Cuantificación relativa del GOI La cantidad de ADN formada en el cruce de la curva cinética de amplificación y la línea de cuantificación es la misma Para la muestra 1, muestra 2, muestra 3, muestra 4, etc. QCq1 = QCq2 = QCq3 = QCq4 = QCqn Condiciones Misma línea de base y línea cuantificación Misma corrida de qPCR Mismo lote de RT Presencia de inhibidores, implica mismo procedimiento extracción, mismo tipo de muestra

Cuantificación relativa del GOI (RQ) Se asigna un valor arbitrario cómo calibrador QCq1 = Qini1 x (Ef)Cq1 QCq2 = Qini2 x (Ef)Cq2 QCq3 = Qini3 x (Ef)Cq3 QCq4 = Qini4 x (Ef)Cq4 Para la muestra 1, muestra 2, muestra 3, muestra 4, etc. QCq1 = QCq2 = QCq3 = QCq4 = QCqn Qini1 x (Ef)Cq1 = Qini2 x (Ef)Cq2 = Qini3 x (Ef)Cq3 = Qini4 x (Ef)Cq4 Para poder tener un valor de las relaciones entre ellos podemos relativizarlos a todas respecto a un mismo valor de Qini y expresión al que denominamos a esta muestra calibrador De esta manera matemáticamente se cancela de las ecuaciones el QCq Qini1 = QCq1 / (Ef)Cq1 Qini2 = QCq2 / (Ef)Cq2 Qini3 = QCq3 / (Ef)Cq3 Se dividen, se relativizan al valor de una muestra arbitraria denominada calibrador Qinical = QCqcal / (Ef)Cqcal Ejemplo para muestra 1 Qini1 / Qinical = (Ef)Cqcal / (Ef)Cq1 entonces RQ1 = (Ef)Cqcal / (Ef)Cq1

Cuantificación relativa: elección del calibrador Muestra calibrador -Muestra real o imaginaria -la relación entre las muestras es siempre las mismas mas allá del valor del calibrador Se usa frecuentemente como calibrador la muestra con mayor Cq o menor Cq o el valor promedio de los Cq de las muestras controles La elección del calibrador o el valor del ciclo no influencia los resultados de la cuantificación relativa; los números pueden ser diferentes pero las diferencia de la relación de la cantidad del GOI en las muestras es idéntica, los resultados son equivalentes nada mas son reescalados. Si embargo la elección del calibrador es importante en el error final de las cantidades relativas si el error estimado para la eficiencia de amplificación es tenido en cuenta en el proceso de propagación de errores. Por la tanto para minimizar este error se recomienda el uso del valor promedio. Lo optimo es usar como calibrador el valor promedio de todos los Cq de las muestras evaluadas. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data;Jan Hellemans, Geert Mortier, Anne De Paepe, Frank Speleman and Jo Vandesompele Genome Biology 2007, 8:R19 (doi:10.1186/gb-2007-8-2-r19)

Cuantificación relativa del GOI (RQ) Cant gen A (Q) en muestra 1 sobre cantidad (real o imaginaria) del gen usado como calibrador Muestra 1 Muestra Calibrador (cal) Cq calibrador es el Cq promedio de todas las muestras evaluadas QCq1 = Qini1 x (Ef1)Cq1 QCqcal = Qinical x (Efcal)Cqcal QCq1 = Qcqcal Cantidad establecida arbitrariamente al establecer la línea de cuantificación Cociente de las dos cantidades Qini1 /Qinical = (Efcal)Cqcal / (Ef1)Cq1 si las eficiencias son iguales Ef1= Efcal en ambos perfiles de amplificación e igual a 2 Qini1 /Qinical = (2)-(Cq1-Cqcal) RQGOI = (2)-deltaCq

Elementos a tener en cuenta para una correcta cuantificación utilizando la curva cinética de amplificación de la qPCR Estimación de la línea de base Establecimiento de la línea de cuantificación Determinación de la eficiencia de la amplificación

El comienzo del fase de crecimiento exponencial La línea de base En todos los tubos hay una fluorescencia de base o de fondo, que se denomina en ingles background fluorescence que se debe a: Colorante libre Auto fluorescencia de la muestra Es una característica normal de la PCR, por lo tanto los equipos lo que hacen es realizar una cuantificación del background y restarle este valor a los valores crudos (R) de fluorescencia de todas las mediciones. ΔR o dR = R – línea de base de la fluorescencia El background es mas evidente y se mide en la primer etapa de la reacción de PCR, donde la cantidad de producto es indetectable y solo se mide background. Durante esta primer etapa entonces se establece la línea de base de la fluorescencia que se obtiene a partir de un algoritmo propio del equipo (o puede poseer varios) y que luego es aplicado a todos los valores de medición de fluorescencia en todos los ciclos de la PCR.

Errores en la estimación de la línea de base Una línea de base errónea provoca: Alteración en la orientación de la curva cinética de amplificación Alteración en los cálculos de eficiencia valor absoluto alto de background Caso 2 Caso 1 En el caso de la eficiencia, se produce por el hecho que un mal calculo de la línea de base por ejemplo en defecto produce la suma de una valor constante que disminuye el valor de eficiencia Caso 3 Valores alto de background generan un valor alto de la línea de base que puede producir la perdida de valores de la fase de crecimiento exponencial Para evitar este error se debe tener en cuenta el intervalo de ciclos que esta seteado en el programa para evaluar a línea de base Primero ciclos de dan comportamientos anómalos Últimos ciclos chequear que no se superpone con Cq de un gen de alta expresión

la línea de cuantificación Ubicada en fase crecimiento exponencial Línea de cuantificación Línea de cuantificación Cq Qn ciclos = Qini x (Ef)Cq Log Qn ciclos = log Qini + log (Ef) x Cq

La línea de cuantificación Diferentes métodos de establecerla La condición de la línea de cuantificación es que se ubique en la zona de amplificación exponencial Nosotros utilizaremos el método fit point que es un método manual donde se chequea en la curva logarítmica que la línea de cuantificación se ubique en la zona de crecimiento exponencial Es importante en el caso que se evalúen varios genes juntos en los cuales no pueden caer para un gene en la zona de crecimiento exponencial y otro no.

La eficiencia de amplificación Qn ciclos = Qini x (Ef)Cq Diferentes corridas diferentes eficiencias Maximización por gen Run layout RQGOI = (Ef)-deltaCq

Determinación de la eficiencia de la qPCR Determinación en cada reacción de cada muestra: medición sobre cada curva de amplificación

Problemas para determinar la eficiencia en cada perfil de amplificación

Escala logarítmica dilución de cDNA cantidad relativa Realizar la curva estándar: (Ef)= 10-1/pte Escala logarítmica dilución de cDNA cantidad relativa Realizar diluciones de cDNA (pool), 1/1, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/200

Cálculos de cantidades relativas con eficiencia erróneas

Problemas de usar Delta delta Cq Medimos la expresión de un GOI y un RG en una muestra y en una dilución de la misma muestra considerando que la eficiencia de ambos son iguales calculando las cantidades relativas normalizadas (NRQ) Problemas de usar Delta delta Cq