CALIDAD HIGIENICO SANITARIA DE LA LECHE CRUDA RECUENTO DE CELULAS SOMATICAS EN LECHE CRUDA RCST Vamos a ver características generales, origen de las células, como afectan a la calidad de la leche, tanto en lo que se refiere a la calidad higiénico sanitaria, como a su posterior industrialización. Métodos de RCST (de referencia y automatizados) Lic. Fabiana A. Castro Tec. Qco. Sebastián Nabais

RECUENTO DE CELULAS SOMATICAS TOTALES Indicador de la situación de mastitis en el rodeo Calidad Higiénico Sanitaria Indicador de la calidad tecnológica de la leche a industrializar El RCST en leche tiene dos objetivos, por un lado se usa como indicador higiénico sanitario del rodeo o la situación de mastitis en el mismo. Cuando hablamos de mastitis estamos hablando de un disturbio secretorio mamario, en el cual seguramente hay involucrados microorganismos patógenos. En cuanto a la calidad o aptitud tecnológica, se va a aver seriamente afectada, ya que altos RCST traen aparejados bajas en la producción, y una materia prima de baja calidad dará un producto final de las mismas características.

MORFOLOGIA DEL TEJIDO MAMARIO Estamos viendo un corte transversal de la ubre, donde se ve un doble ligamento que la divide en dos y a su vez, estas dos mitades nuevamente divididas, en este caso por una membrana fina que divide cada mitad en dos cuartos. Estos 4 cuartos son totalmente independientes. En el corte vertical podemos observar los alvéolos, compuestos de una capa simple de células epiteliales cúbicas (columnas en lactancia). Por debajo de ellas existen células mioepiteliales contráctiles (responden a occotocina) y por debajo membrana basal. Todos los alvéolos estaá rodeados por tejido conectivo y capilares sanguíneos. Los alvéolos derivan en túbulos y microtúbulos tapizados por células NO secretoras. Desembocan en la cisterna de la glándula, luego cisterna del pezón y canal del pezón.

ORIGEN DE LAS CELULAS SOMATICAS Aquellas que provienen de descamación natural o patológica del epitelio mamario: EPITELIALES Aquellas que provienen del torrente sanguíneo pertenecientes al sistema de defensa del animal: MACROFAGOS, LINFOCITOS, POLIMORFONUCLEARES Epiteliales> se originan en los alvéolos y conductos del tejido mamario, aunque no se diferencian morfológicamente por su localizacioón. Polimorfo> núcleos de dos o más lóbulos. Gral. Neutrófilos. Se originan en la médula ósea. Atraviesan paredes vasculares. Fagocitan partículas extrañas, bacterias. NO son específicos Linfocitos> esféricas de núcleos compactos. Aumentan en infecciones crónicas Responden a estímulo de Ag. Macrófagos> núcleos esféricos más grandes que los linfocitos.Aparecen en infecciones crónicas. No son específicos.

Acá estamos viendo un corte transversal de la ubre, en la que se ve la ruta que siguen las bacterias potencialmente mastitogénicas. Hay que tener en cuenta que existen mecanismos de defensa. Entre la cisterna del pezón y el canal del pezón, hay una zona llamada ROSETA DE FURSTENBERG, que contiene una concentración estable de leucocitos. Por otro lado la descamación contínua de células epiteliales, resulta en la formación de queratina, que ocluye la luz del canal del pezón entre ordeñes y por otra parte actúa coomo barrera por adsorción de bacterias, que son eliminadas por descamación durante el ordeñe, impidiendo su ingreso a instancias superiores. Esto constituiría la primera línea de defensa La segunda línea son células ya presentes en la glándula mamaria sana. El estímulo del ordeñe induce directamente la migración de PMN. Existe un monitoreo constante de MACROFAGOS Canal del pezón> longitud 3 – 18 mm diámetro 0,35 mm a 5 mm.

NIVELES DE RECUENTOS DE CELULAS SOMATICAS No existe un recuento que pueda decirse que marca una línea divisoria entre el recuento de una leche proveniente de una vaca sana del que proviene de una vaca enferma No existe evidencia de que un recuento en particular tenga, por sí mismo, un efecto significativo en la salud humana Sin embargo se sabe que cuanto más alto es el recuento, mayor es el riesgo de contaminación de la leche y de encontrar residuos de antibióticos El límite se establece para minimizar el posible riesgo a la salud pública.

INDICADOR HIGIENICO SANITARIO En la leche de una vaca sana, no infectada, el máximo de células encontradas es un promedio de 150.000 cel/ml. En la leche de vacas enfermas el promedio de células encontradas es de 400.000 cel/ml, aunque existen vacas con valores de millones. Estos valores pueden variar dependiendo de la raza del animal. Vaca individual menor a 100.000 por arriba de 200.000 indica inflamación el la ubre. Leche de pool

CAMBIOS EN LA COMPOSICION QUIMICA DE UNA LECHE CON MASTITIS Incremento en el número de células somáticas Liberación de proteínas del plasma sanguíneo a la leche (Ig, plasmina, BSA, etc.) Daño a la integridad celular, con la consiguiente liberación de constituyentes intracelulares a la leche y disminución de la capacidad sintética del epitelio mamario (Nagasa, lactosa, caseína, etc.) Proteínas del plasma: Ig, BSA aparecen debido a cambio de permeabilidad en la membrana.(capilares sanguíneos) Plasmina> se encuentra naturalmente en leche. Su actividad aumenta al doble. El plasminogen, es su precursor inactivo que se encuentra en el plasma. Esta enzima proteolítica causa un daño específico a la caseína. Es estable a altas temperaturas, por lo que la pasteurización puede no inactivarla. Su acción es relativamente lenta a bajas temperaturas, pero puede provocar deterioro, por ej. En leches UAT durante su almacenamiento – comercialización. El daño del epitelio mamario, la baja de la velocidad del flujo sanguíneo, como consecuencia de la inflamación, y consecuentemente la baja del aporte de precursores de la leche, denotan en la baja rendición de síntesis de sus componentes. Al aumentar el Na y el Cl, aumenta la presión osmótica, lo que inhibe la producción de lactosa, ya que es la sust. Osmóticamente más activa de la leche. También hay fuga por cambios de permeabilidad La N acetil Beta D glucosaminadasa es una enzima lisozimal, actúa sobre células epiteliales, es un indicador de daño del tejido. La producen los PMN y los linfocitos

CAMBIOS EN LA COMPOSICION QUIMICA DE UNA LECHE CON MASTITIS Reducción de la grasa, proteína, lactosa. Ej. Con un valor de 1.000.000 cel/ml la reducción de la lactosa es de un 10%, para grasa es de un 5% a un 10%. Esto genera una caída en el rendimiento. Proteína: No se verifica una baja global considerable, ya que se ve compensada por las proteínas de origen sanguíneo, pero sí una considerable disminución de su calidad. Incremento de los ácidos grasos libres, proteínas del suero, lactoferrinas, sodio, cloruro y enzimas. Esto genera inhibiciones inespecíficas de fermentos. Disminución de grasa> reducida por baja actividad sintética y por PMN que fagocitan de manera inespecífica. Proteínas> hay pequeños cambios en cuanto a su contenido total, ya que si bien se disminuye la capacidad sintética, hay una compensación por proteínas del suero (Ig, SBA). Sí hay cambios importantes en la composición , la caseína se ve fragmentada por ezimas proteolíticas. Se observa un incremento de proteínas baja calidad en el suero. La acción proteolítica de enzimas aportadas por CS provoca roturas en las cadenas de aa original, dando coagulaciones inapropiadas en quesos. Fragmentos de caseína pasan al suero, disminuyendo rendimientos. Aumento de ácidos grasos libres por acción de lipasas (de CS) provoca sabores rancios (tanto en productos de alto contenido graso, como en productos con sabores suaves, quesos crema, untable, etc. Deterioro de sabores durante la comercialización del producto. Lactoferrina> principal proteína antibacterial (bacteriostática) incrementa su concentración. Se encuentra en granulaciones de PMN. Na y Cl> Aumentan su concentración por permeabilidad y K sale por células dañadas. Relación normal K/Na 3:1 (puede invertirse). Aumento de la conductividad de la leche. pH> Aumenta principalmente por aumento de iones bicarbonato. Leches alcalinas Calcio> como está asociado a la caseína el desorden en la síntesis provoca una disminución. Idem con fósforo.

COMUNIDAD ECONOMICA EUROPEA Recuento de células somáticas totales: menor o igual a 400.000 cel/ml. Recuento en placa a 30ºC: menor o igual a 100.000 UFC/ml. Ausencia de residuos de antibióticos Si no cumple con estas especificaciones, entonces esta leche no podrá ser destinada a consumo humano

METODOS PARA DETERMINAR EL RECUENTO DE CELULAS SOMATICAS EN LECHE CRUDA Método de referencia: Recuento al microscopio directo Métodos automatizados: método fluoro-opto-electrónico, método utilizando el principio CCD y el contador de partículas Métodos indirectos: California mastitis test, Wisconsin mastitis test y el viscosímetro

METODO DE REFERENCIA: RECUENTO AL MICROSCOPIO DIRECTO Homogeneización de la muestra Extendido de 10µl de muestra/cm2 por duplicado Secado Tinción: Azul de metileno – 30 minutos. Composición del colorante/100 ml Azul de metileno ………... 0,6 g Etanol (95% v/v)……….. 54,0 ml Xileno…………………... 40,0 ml Acido Acético glacial……. 6,0 ml Homogeneización baño termostático a 40 + - 2ºC Extendido con micropipeta controlada Colorante La fijación se consigue principalmente mediante la coagulación de la proteína. El alcohol etílico, por sí solo, no es buen fijador. Tiene la ventaja de conservar sin alterar los componentes celulares. En este caso se utiliza una mezcla en la que interviene el ac. Acético glacial que aumenta el poder de penetración de la mezcla en el preparado. Su gran difusibilidad hace que la mezcla llegue rápidamente a las regiones más profundas d elas piezas, originando una coagulación inicial. Xileno> extrae grasa disuelve lípidos En este caso se trata de una coloración simple, ya que se tiñe solamnete algunos componentes del preparado (núcleos) Es una coloración ortocromática debido a que las estructuras adquieren el color del colorante. El azul de metileno es un colorante BASICO (sal de base coloreada y acido incoloro). Es colorante nuclear. Tiñe ácidos nucleicos Tiñe sustancias BASOFILAS. Colorantes ácidos> sal de base incolora y ácido coloreado (eosina o eosinato de sodio) Son colorantes plasmáticos. Neutros> sal cuya base y ácido son coloreados. (eosinato azul de metileno, tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. Lavado – secado - identificación Lectura al microscopio

Se cuentan todas las células (núcleos teñidos) claramente identificable. Se realiza screening para observar material nuclear, estimar el tamaño nuclear de modo de no contar fragmentos celulares. Aquellas células que tienen por lo menos la mitad del material nuclear dentro del campo examinado.

FACTOR DEL MICROSCOPIO 7 células 3 campos d =  r2 d = 200 µm d = 0,2 mm Sup = 3,1416 . 0,01 mm2 Sup = 0,031416 mm2 Sup = 0,00031416 cm2 Superficie del campo visual 3180 campos 3,1416 10-4 cm2/campo 1 cm2 Número de campos en 1 cm2 = Recuento con objetivo de inmersión. Aceite de inmersión Aumento> objetivo 100x y ocular 10x Factores 300000 y 600000 Tornillo micrométrico o slide micrométrico con divisiones de 0,1 mm y 0,01 mm Número de campos por ml de leche 0,01 ml  3200 campos 1 ml  320000 campos 320000 campos/ml FM X células . 320000 campos campos ml = X células

PRECISION La precisión de un método analítico expresa el grado de dispersión entre una serie de resultados obtenidos a partir del análisis de una misma muestra homógenea. Se expresa como la desviación estandard, o el coeficiente de variación (Cv) La precisión puede ser considerada a dos niveles: REPETIBILIDAD y REPRODUCIBILIDAD

Cv =  . 100 x REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD RCST < 400.000 cel/ml RCST > 400.000 cel/ml Cvr  10% CvR  20% Cvr  5% CvR  10%

EXACTITUD Utilización de estándares de referencia Participación en ensayos interlaboratorio

METODOS AUTOMATIZADOS Y METODOS INDIRECTOS

METODO FLUORO-OPTO-ELECTRONICO

METODO FLUORO-OPTO-ELECTRONICO

Diodos Detectores Canal 4 Película leche Canal 3 4 mm Canal 2 Canal 1 *Ninguna parte de la película de muestra debe salir de la zona de vista de los detectores

CALIFORNIA MASTITIS TEST