“TECNICAS MOLECULRES DE DETECCIÓN DE MICRODELECIONES Y DUPLICACIONES” Universidad Nacional de San Luis Facultad de Química. Bioquímica y Farmacia Departamento de Cs. Biológicas Área de Biología Molecular “TECNICAS MOLECULRES DE DETECCIÓN DE MICRODELECIONES Y DUPLICACIONES” Profesor: Lic. Silvana M. Marsá

Complemento de la técnica de citogenética Hibridación in situ: Marcar o identificar una secuencia de ADN con una sonda específica que reconoce dicha secuencia Sonda: Secuencia de ADN marcadas con un fluorocromo, específicas, que reconocen una determinada secuencia del genoma Alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales tanto en células que no entran en división (interfase) como en células en división (metafase)

Identificación de anomalías cromosómicas crípticas o difíciles de detectar para la citogenética convencional Por el hecho de permitir identificar mutaciones en interfase, simplifica el procesamiento de la muestra al no requerirse cultivo

Puede aplicarse en células depositadas en un portaobjetos de microscopia (frotis convencional, impronta de tejido) hasta cortes de tejido incluidos en parafina Se ha usado esta técnica para muestras en parafina almacenadas durante años (hasta 12) a tª ambiente Técnica de elección (por delante de la PCR) para búsqueda de translocaciones y para delecciones

Muestras Preparaciones de citogenética convencional tras cultivo de médula ósea, sangre periférica, ganglio u otros tejidos La muestra obtenida de estos cultivos se conserva en solución Carnoy También es aplicable a extensiones en fresco de muestras biológicas

MLPA

Methylation-specific MLPA® (MS-MLPA)

mRNA MLPA® (RT-MLPA)

INFORME DEL ANÁLISIS MUTACIONAL Fecha de recepción de muestra: Nombre: Muestra: sangre Enfermedad: Síndrome de microdeleción 22q11.2 Solicita: análisis de cambio en el número de copias por kit P250 (MRC-Holland) Test: Análisis de cambio en el número de copias por kit P250 (MRC-Holland) Metodología: MLPA (Multiplex LigationProbeAmplification) Detalle: El ADN del paciente se hibridó con 30 sondas específicas para la región 22q11 relacionada con Síndrome de microdeleción 22q11 y con diferentes sondas control. Posteriormente los productos de hibridación se ligaron y amplificaron en conjunto por PCR con primers marcados. Los productos de amplificación fueron separados por electroforesis capilar y analizados con el software GeneMarker v1.75. Resultado: La muestra del paciente NO presenta alteración numérica en ninguna de las 30 regiones estudiadas, comparado con una muestra control sana. Análisis del ratio (GeneMarker v1.75) entre el número de copias de cada región genómica de un control sano y del paciente. Cada punto representa un gen o región genómica. Los puntos entre ambas líneas horizontales verdes se encuentran dentro del rango de ratio aceptado. Los 30 puntos relacionados con la región 22q11 se encuentran dentro del rango de desvío aceptado y no presentan alteración numérica respecto de un control sano.

Informe de Estudio Genético Molecular Estudio de Metilación Específica 15q11-q13 Síndrome de Prader-Willi (PWS)- Síndrome de Angelman El estudio genético-molecular del estado de metilación en la región cromosomal 15q11-q13, realizado a través de MS-PCR (PCR específica de metilación) permite estudiar pacientes afectados de síndrome de Prader-Willi y pacientes afectados de síndrome de Angelman*. El presente estudio se realizó sobre ADN extraído de leucocitos del paciente XXX. Los resultados obtenidos mostraron un patrón de metilación normal en 15q11-q13 observándose la presencia de ambos alelos, paterno y materno. La presencia de alelo paterno hace poco probable el diagnóstico de Síndrome de Prader-Willi (PWS). La presencia del alelo materno hace poco probable el diagnóstico de Síndrome de Angelman*. Los resultados obtenidos deben considerarse en relación a la clínica del paciente *El estudio de metilación de la región 15q-q13 confirma el diagnóstico de síndrome de Angelman solo en -70-80% de los casos. Pacientes afectados de Síndrome de Angelman con un patrón de metilación mosaico, o aquellos con metilación normal pero portadores de mutación en el gen de la proteína ligasa de ubiquitina 3 A (gen UBE3A), no son detectados con el estudio de metilación (o FISH). En estos pacientes se debería estudiar el gen UBE3A El valor diagnóstico de este resultado es dependiente de las limitaciones inherentes a las metodologías utilizadas

Fecha: Nombre: Muestra: sangre Enfermedad: Síndrome de Prader-Willi/Síndrome de Angelman Solicita: análisis de cambio en el número de copias y alteración de metilación por kit ME028 (MRC-Holland) Test: Análisis de cambio en el número de copias/alteración perfil de metilación por Kit ME028 Metodología: MS-MLPA (Methylation Specific-Multiplex Ligation Probe Amplification) Detalle: El ADN del paciente se hibridó con sondas específicas para analizar cambio en el número de copias y cambios del perfil de metilación en la región 15q11 relacionada con Síndrome de Prader-Willi/Angelman. Las sondas específicas para analizar cambio en número de copias fueron: 1 sonda para el gen MAGEL2, 6 sondas para el gen UBE3A, 1 sonda para el gen NIPA, 1 sonda para el gen TUBGCP5, 1 sonda para el gen MKRN3, 2 sondas para el gen GABRB3, 2 sondas para el gen NDN, 15 sondas para el gen SNRPN y 2 sondas para el gen ATP10A. Las sondas específicas para analizar alteración del perfil de metilación fueron: 4 sondas para el gen SNRPN y 1 sonda para el gen NDN. A su vez, se incluyeron varias sondas control en el ensayo. Luego de la hibridación, los productos se ligaron y una parte de la muestra fue tratada con una enzima de restricción metil-sensible para analizar alteración en el perfil de metilación. A continuación, se amplificaron los productos de ligación por PCR con primers marcados. Los productos de amplificación fueron separados por electroforesis capilar y analizados con el software GeneMarker v1.75.

PCR-Multiplex

INFORME DEL ANÁLISIS MUTACIONAL Fecha: Nombre: Sexo: Masculino Muestra: sangre Enfermedad: Distrofia Muscular de Duchenne Solicita: análisis de alteraciones numéricas en el gen DYS Test: Análisis de cambio en el número de copias de los 79 exones del gen DYS por kit P034-P035-A2(MRC-Holland). Metodología: MLPA (Multiplex LigationdependentProbeAmplification) Detalle: El ADN del paciente se hibridó con sondas para cada uno de los 79 exones del gen DYS. Posteriormente los productos de hibridación se ligaron y amplificaron en conjunto por PCR con primers marcados. Los productos de amplificación fueron separados por electroforesis capilar en un ABI3130 y analizados con el software GeneMarker v1.75. Resultado: La muestra del paciente NO presenta alteración numérica en ninguno de los 79 exones del gen DYS, comparado con una muestra control normal. Panel exones: 1-10; 21-30; 41-50; 61-70 Panel exones: 1-20; 51-60; 31-40; 71-79 Análisis del ratio (software GeneMarker v1.75) entre el número de copias de cada exón del gen DYS del paciente y de un ADN control sano. Cada punto representa un exón. Los puntos entre ambas líneas se encuentran dentro del rango de desvío aceptado y no presentan alteración numérica.

INFORME DEL ANÁLISIS MUTACIONAL Nombre: Sexo: masculino Muestra: muestra de sangre Enfermedad: Distrofia Muscular de Duchenne Solicita: análisis de alteraciones numéricas en el gen DYS Test: análisis de cambio en el número de copias de los 79 exones del gen DYS. Metodología: MLPA (Multiplex LigationdependentProbeAmplification) Detalle: El ADN del paciente se hibridó con sondas para cada uno de los 79 exones del gen DYS. Posteriormente los productos de hibridación se ligaron y amplificaron en conjunto por PCR con primers marcados. Los productos de amplificación fueron separados por electroforesis capilar en un ABI3130 y analizados con el software GeneMarker v1.75. Resultado: La muestra del paciente presenta una alteración en el exon 58 del gen DYS, comparado con una muestra control normal. Se detecta una disminución del 60-80% en la señal de una sonda específica para la región del exon 58. Esta disminución parcial de un único exon puede deberse a la presencia de un SNP en el exon 58 que disminuya la eficiencia de hibridación de la sonda, o a un SNP o delecion del exon 58 en mosaico. Se sugiere confirmar por secuenciación del exon 58 del gen DYS. Panel exones: 1-10; 21-30; 41-50; 61-70 Panel exones: 11-20; 51-60; 31-40; 71-79 Análisis del ratio (software GeneMarker v1.75) entre el número de copias de cada exón del gen DYS del paciente y de un ADN control. Cada punto representa un exón. Los puntos entre ambas líneas se encuentran dentro del rango de desvío aceptado y no presentan alteración numérica. El punto por debajo de la línea horizontal inferior presenta alteración numérica respecto del control, detectándose una disminución del 60-80% de la señal de la sonda para el exon 58.

INFORME DE ANÁLISIS MUTACIONAL Fecha: Nombre: Muestra: sangre Enfermedad: Síndrome de Williams Beuren Solicita: análisis de cambio en el número de copias y alteración de metilación por kit P064 CI (MRC-Holland) Test: Análisis de cambio en el número de copias de ADN, por kit P064 C1 (MRC-Holland) Metodología: MS-MLPA (Methylation Specific-Multiplex Ligation Probe Amplification) Detalle: El ADN de la paciente se hibridó con 3sondas para los exones 4, 6 y 27 del gen ELN ubicado en el cromosoma 7q11.23 relacionado con el síndrome de Williams Beuren, y diferentes sondas control. Posteriormente los productos de hibridación se ligaron y amplificaron en conjunto por PCR con primers marcados. Los productosde amplificación fueron separados por electroforesis capilar y analizados con el software GeneMarker v1.75. Resultado: La muestra de la paciente presenta alteración numérica (deleción) en las 3 sondas del gen ELN, comparado con un control sano. Análisis de ratio (GeneMarker v1.75) entre el número de copias de cada región genómica de un control sano y de la paciente. Cada punto representa una región genómica. Los puntos entre líneas horizontales se encuentran dentro del rango de desvío aceptado y no presentan alteración numérica. Los puntos por debajo de la línea horizontal inferior corresponden a las 3 sondas del gen ELN, infiriéndose una deleción.