Producción de proteínas recombinantes en cél eucariotas Problemas que suelen aparecer cuando proteínas eucarióticas se expresan en cél procariotas inestables sin actividad biológica contaminantes procarióticos

Sistemas de expresión eucariotas Para eliminar los problemas de expresión en procariotas, se han desarrollado sistemas de expresión eucariotas Esp. importantes para proteínas terapéuticas Necesidad de que tengan idénticas propiedades a la proteína natural : bioquímicas biofísicas funcionales

Sistemas de expresión eucariotas Cuál es la diferencia? Modificación post-traduccional de la mayoría de las proteínas eucariotas Cél procariotas no pueden realizar estas modificaciones

Modificaciones post-traduccionales Formación de uniones disulfuro correctas Clivaje proteolítico del precursor inactivo Glicosilación- agregado de residuos de azúcar Alteración de aminoácidos en la proteína fosforilación acetilación agregado de grupos sulfato Agregado de ácidos grasos

Sistemas de expresión en levaduras: ventajas Organismo unicelular Bien caracterizadas genética y fisiológicamente Promotores fuertes disponibles Plásmido natural (2µm) Eucariotas, ocurren modificaciones post-transduccionales Segregan algunas proteínas No patógeno

Vectores de levaduras YIp: integrativos YEp: episomales - una copia integrada a un cromosoma YEp: episomales - ori 2m (alto número de copias) YCp: centroméricos ARS, CEN (1 o 2 copias por cél) Todos tienen marcador de auxotrofia y son shuttle

Vectores episomales Son ampliamente usados A menudo inestables en cultivos a gran escala (>10L) Estrategia - alterar las condiciones de crecimiento para estabilizar el vector episomal usar cepas mutantes que requieren nutrientes específicos. Leucina, Triptofano, Histidina el gen que provee el fenotipo salvaje se encuentra en el plásmido episomal

Promotores de levaduras Promoter Status Acid phosphatase PHO5 Inducible Alcohol dehydrogenase I ADH I Constitutive Alcohol dehydrogenase II ADH II Inducible Galctokinase GAL 1 Inducible Metallothionein Cup 1 Inducible Phosphoglycerate kinase PGK Constitutive Triose Phosphate isomerase TPI Constitutive

Sistemas de expresión en levaduras: desventajas Inestabilidad de plásmidos en gran escala Vectores episomales Superglicosilación de glicoproteínas 100+ residuos manosa vs. 8-13 normal puede alterar la actividad de la proteína Proteínas secretadas quedan atrapadas en periplasma (entre la membrana y la pared celular) se usan señales peptídicas

Soluciones a los problemas en sistemas de expresión en levaduras Levaduras modificadas genéticamente para llevar a cabo glicosilación = humanos Science Vol 301, p1244-1246 (29 Aug 2003) Deleción de genes de glicosilación de levaduras Agregado de genes de glicosilación humanos

Soluciones a los problemas en sistemas de expresión en levaduras Usar otro tipo de levaduras Pichia pastoris Hansenula polymorpha No sólo Saccharomyces cerevisiae Usar otros eucariotas Cél de insectos Cultivos de cél de mamíferos