Expresión de genes en E.coli

Presentación del tema: "Expresión de genes en E.coli"— Transcripción de la presentación:

1 Expresión de genes en E.coli
Factores que influyen en la elección de un sistema de expresión tamaño de la proteína cantidad de proteína necesaria proteína activa

2 Promotores más utilizados
lac (or lacUV5) trc tac phage T7 gene 10

3 Promotor tac (trc) Híbrido de promotores lac y trp región -35 de trp
region -10 de lac separados por 16bp = promotor tac separados por 17bp = promotor trc Regulado por el represor lac 3x más fuerte que trp 10x más fuerte que lac

4 Promotor del gen 10 del fago T7
Todos los promotores del fago T7 (incluído el gen 10) requieren la T7 RNA Polimerasa para expresarse El gen de la T7 RNA Pol puede estar bajo el control del promotor lac en cél de E.coli El gen de interés puede estar bajo el control del promotor del gen 10

5 Promotor del gen 10 del fago T7
T7 RNA Pol Inducer lac pro T7 RNA Pol Protein of Interest T7 RNA Pol g10 pro gene of interest

6

7 Para aumentar la expresión de la proteína
1) Promotor 3) Secuencia de Shine Dalgarno 4) Localización celular (secretada) 5) Estabilidad de la proteína 6) Organismo húesped 7) Número de copias del gen clonado

8 Para aumentar la traducción
Un promotor fuerte producirá mucho mRNA Será necesaria una efectiva traducción para obtener mucha proteína DNA RNA Proteína

9 Para aumentar la traducción
En procariotas La señal de traducción es RBS: Ribosome Binding Site Secuencia de Shine-Dalgarno 6-8 nt Localizada a corta distancia (~10nt) upstream del codón de iniciación de la traducción AUG

10 Shine Dalgarno Secuencia complementaria a región en 16S rRNA de la subunidad pequeña del ribosoma mRNA 5’ UAAGGAGG AUUCCUCC AUG 3’ 3’ 16S rRNA 5’ small ribosomal subunit

11 Evitar estructura secundaria
Región del codón de iniciación AUG en extremo 5’ del mRNA no debe ser complementaria a sí misma podría bloquear el movimiento del ribosoma y evitar la traducción

12 Uso de codones Utilización de codones
varios codones para cada aminoácido algunos codones usados poco frecuentemente bajas cantidades de los correspodientes tRNAs Organismos diferentes pueden usar diferentes codones a diferentes frecuencias

13 Codon Usage in E. coli & humans

14 Estrategias para optimizar el uso de codones
Sintetizar químicamente un nuevo gen Alterar la secuencia del gen de interés Elegir codones que sean los más usados en el organismo húesped Expresar en un húesped diferente Elegir húesped con el mismo uso de codones Usar una célula húesped modificada Sobreexprese tRNAs de baja abundancia

15 Vector de expresión pKK233-2
selectable marker tac promoter RBS unique REase sites Txn terminators not shown: ori of replication