Electroforesis La electroforesis es una técnica que se basa en la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico. Tipos: De frente móvil (en solución) De zona (sobre un medio soporte) Geles (a través de una matríz porosa) En papel Sílice Agarosa Poliacrilamida (DNA) (DNA y proteínas)

- + v Fel Cátodo Ánodo Fresist Fel = Q . E = Q . V/d Q = carga E = potencial eléctrico V = voltaje d = distancia entre electrodos f = coeficiente de fricción v = velocidad Fresist = f . v Tamaño y forma de la partícula A v constante Fresist = Fel v partícula = Q . E f Movilidad de la partícula m = v = Q E f

La movilidad del DNA depende de: Factores extrínsecos a la partícula [agarosa] o [poliacrilamida] Voltaje Buffer Tiempo Temperatura pH Factores intrínsecos a la partícula Relación carga/masa Conformación Tamaño

Factores extrínsecos

[ ] Agarosa Log(PM o Kbs) m m b > m a 0,5% 0,7% 1% 1,2% % de agarosa a b m b > m a A > % de agarosa la movilidad de la partícula disminuye A > % de agarosa la resolución de partículas de PM similar aumenta

= Poliacrilamida Agarosa % agarosa Rango separación poliacrilamida 1-5 pb a 500 pb 0,5 700 pb a 25 Kpb 0,8 500 pb a 15 Kpb 1 250 pb a 12 kpb 1,2 150 pb a 6 kpb 1,5 80 pb a 4 kpb * Fragmentos grandes de DNA se corren en geles de agarosa de campo pulsante = Poliacrilamida Agarosa Alta resolución Baja resolución (poros grandes) NO para fragmentos grandes SI fragmentos grandes Difícil de armar Fácil de armar Si el % es muy bajo el gel es frágil

Voltaje aplicado 100 V – 130 V V típico = 10 V / cm de gel y geles de 10 – 15 cm Mejor resolución Voltajes menores (70 V) (máxima resolución fragm. > 2kb, se corre a 5 V / cm de gel) OJO, V difusión

Buffer de corrida Da la fuerza iónica al medio de corrida Al la [ ] de iones, la resolución Composición TAE TBE TPE Más usado. No puede reciclarse mucho. Mayor capacidad buffer

Tiempo Temperatura pH Depende del tamaño de los fragmentos a separar A tiempo resolución OJO! (Que no se caiga la muestra del gel) Temperatura A V Temperatura y la m OJO! (Se puede fundir el gel) pH Evitar modificaciones en la carga y conformación del DNA y las proteínas Hay que controlar el pH

Factores intrínsecos

Relación Q/m Tamaño Imp. para proteínas: Q/m m Ac. Nucleicos: Q/m constante! Tamaño tamaño m

Conformación del DNA DNA circulares: 3 conformaciones posibles - CA Circular abierto Lineal CCC Circular covalentemente cerrado (superenrrollado) + 0,6 a 1% agarosa Si el % de agarosa es de 1 a 1,4 % corren: 1ro. el Lineal, 2do. el CCC y 3ro. el CA

Loading Buffer Glicerol o ficol o sacarosa Densidad a la muestra Azul de bromofenol (corre como DNA 300 pb) Colorantes de corrida (ubicar frente de corrida) Xylene Cyanol (corre como DNA 4000 pb) Orange G (corre como DNA 50 pb)

Revelado Autorradiografía DNA marcado radioactivamente (Ej. PCR radioactiva) BrEt - Se intercala cada 2,5 pb - Fluoresce naranja a la luz UV - Detecta hasta 10ng de DNA ds - En la agarosa o post-corrida Genera SC(+). Afecta movilidad CCC. Retrasa 15% lineal Visualización durante corrida (tumorigénico) Agentes intercalantes Fluoresce amarillo Poca afinidad gel (bajo background) Detecta hasta 20 pg DNA ds Seguro (no tumorigénico) Caro SyBR Gold

Marcadores de peso molecular cualitativos sintéticos Marcadores de peso molecular DNA fagos o plásmidos digeridos por ER cuantitativos Sintéticos comerciales

Marker Lambda EcoR1/HindIII Cuantificación DNA Tamaño DNA fagol = 48,5 kb Muestra 48,5 kb 100% 3,53 kb 7,28% Marker Lambda EcoR1/HindIII Intensidad similar Si sembré 500 ng marker DNA: 100% 500 ng 7,28% 36,4 ng % por el vol de DNA muestra sembrado para obtener la [ ]

Tipos de geles de agarosa Analíticos Comunes Preparativos Alcalino (c/NaOH) Para cDNA Para RNA Con formaldehído (desnaturaliza RNA) PGFE (en campo pulsante) Separación de fragm. > a 50 kb

Recuperación del DNA del gel Agregar al gel membrana de DEAE-celulosa Colocar trozo de gel en bolsa de diálisis Kits de sílica gel Usar low melting point agarosa (funde entre 25-35 grados). Extracción con fenol. Corte en gel durante la corrida, seguir con UV y levantar cuando DNA cae en el pocillo