Air-cooled Argon Ion Laser Aplicación de la citometría de flujo al estudio de la enfermedad mínima residual en leucemias agudas 11 de octubre de 2007 Air-cooled Argon Ion Laser Beam Shaping Lenses High Sensitivity Quartz Flow Cell Forward Scatter Detector Side Scatter 525BP FL1 (FITC) 575BP FL2 (RD1) 620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5) 488DL 488BK 550DL 600DL 645DL Anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos Láser, cámara de flujo y sistema óptico

Leucemias Agudas. Respuesta al Tratamiento Remisión completa morfológica Remisión completa citogenética AMO: < 5% blastos SP: plaquetas > 100x109/L RAN > 1x109/L Cariotipo normal

Enfermedad Residual Mínima 5% 10-5 E.Indetectable EMR Recaída Tiempo MORFOLOGÍA CITOGENÉTICA PCR CITOMETRÍA % Blastos en M.O. Tratamiento Inducción Tratamiento Consolidación TPH Tratamiento Mantenimiento Carga 1012 1010 100-2

Morfología Normal LMA M0 LMA M1 La morfología con frecuencia no es capaz de distinguir el origen de los blastos. Así, con el mismo aspecto morfológico estos blastos pueden corresponder a un mieloblasto normal, el de una Leucemia minimamente diferenciada, el de una l. Sin maduración, el de una megacariocítica o incluso el de una linfoblástica. La presencia de bastones de Auer es el único signo patognomónico de un origen mieloide de los blastos. LLA LMA M7

Morfología (LLA post inducción) Linfoblastos reactivos Linfoblastos LLA pro B

Morfología (LLA post inducción) Linfoblastos LLA bcr-abl Linfoblastos reactivos

EMR. CFM Características de la muestra Aspirado medular Debe ser representativo de médula ósea aspirado enérgico 1,5 mL de muestra evitar la dilución con sangre medular Procesar en < 24 horas Evitar pérdidas selectivas de células

Estudio Inicial de la Leucemia Objetivos de la CFM Diferenciar las LMA de las LLA (B y T). Subclasificación precisa de las LLA (B y T). Diagnóstico preciso de M0, M6 (maduras) y M7. Diagnóstico de L.A. bifenotípicas y L.A. con marcadores aberrantes. Orientar la búsqueda de alteraciones citogenéticas específicas: My: t(8;21) (ETO-AML1); t(15;17) (PML-RARa); inv(16) (CBFb-MYH11X) Ly: t(9;22) (BCR-ABL); t(v;11q23) (MLL); t(1;19) (E2A-PBX1); t(12;21) (TEL-AML1) Detección de IFL al diagnóstico para el seguimiento de EMR.

EMR. Citometría de flujo multiparamétrica PASOS: En el momento del diagnóstico: 1. Inmunofenotipos Leucémicos (IFL) 2. Diseñar paneles de seguimiento específicos Durante el seguimiento: 3. Obtención de muestras adecuadas 4. Aplicación de los paneles de seguimiento 5. Adquisición: Live gate

EMR. CFM Estrategia de live-gate o list-gate 1. Se adquieren 20000 leucocitos y se establece el % de células B 2. En una live-gate (azul) se adquieren sólo las células CD19+ 3. Células CD19+ con el fenotipo leucémico CD20-CD10- 4. Células CD19+ con el fenotipo leucémico CD34+ CD10- Inmunofenotipo leucémico al diagnóstico: CD19+CD34+CD10- y CD19+CD20-CD10-

Morfología vs Inmunofenotipo CD20 CD20 CD10 CD10

EMR. LLA-B MLL+ Normal IFL: CD19+ CD20- CD10- (LAL Pro-B) EMR: 1,43%

Post-Inducción: 0,14% de células CD19+CD13+ (histogramas 1 y 2). Post-Consolidación: EMR no detectable (histogramas 3 y 4).

Médula ósea en recuperación post QT (LMA-M2 en RC)

EMR. LLA-B común (TEL-AML1) IFL: CD19+ CD45- EMR: 0,024%

EMR. LLA-B (BCR-ABL) Expresión normal Expresión anómala

LLA-B MLL+. Evolución EMR Ddiagnóstico (sp) LLA pro-B Post-Inducción EMR: 0,058% 4 meses después del diagnóstico ER: 30,6%

Estudio Inicial de la Leucemia. CFM Inmunofenotipos Leucémicos (1) LLA-B (n=43) Entre 1 y 5 IL/ paciente LLA-T (n=4) 3 IL/ paciente (1) No incluidos KOR-SA ni NG2

Fenotipos aberrantes en LMA 126 pacientes (San Miguel- Blood 2001) Asincronía de antígenos (78%) CD34+/ DR -/CD33+ (9%) CD34+/CD56+ (8%) CD34+/CD11b+ (5%) CD34+/CD33++ (3%) CD34+/CD14+ (3%) CD34+/CD117+/DR - (2,3%) CD34+/CD117-/CD15+ (2,3%) CD34+/CD3-/CD13+/DR+ (1,5%) CD34+/CD3-/CD13+/DR- (0,8%) CD34+/CD3-/CD117+/DR+ (0,8%) CD117+/CD33+/DR- (11%) CD117+/CD34-/CD15- (6%) CD117+/CD11b+ (5,5%) CD117+/CD33+/CD34-/CD15+ (4%) CD117+/DR-/CD15+ (2,3%) CD117+/DR-/CD15- (2,3%) CD117+/DR+/CD33+/CD34- (0,8%) CD33++/DR-/CD34-/CD15-/CD14- (17%) CD33-/CD13+ (14%) CD33+/CD13- (7%) CD33+/DR+/CD4+/CD45dim (0,8%) CD33+/DR+/CD15-/CD14- (0,8%) CD33+/CD45d/CD34-/CD15- (0,8%) CD33+/DR+/CD56+/CD13+ (0,8%) Infidelidad de línea (29%) CD2 (21%) CD7 (9%) CD19 (2%) CD20 (0,8%) CD5 (0,8%) Sobrexpresión (21%) CD33 (11%) CD34 (9%) CD13 (2%) CD117 (0,8%) CD15 (0,8%) Anormal FSC/SSC (17%) Alto FSC/SSC (13%): CD2, 34, 7, 117, 19, 20 Bajo FSC/SSC (4%): CD13, 33,15

LLA-B. Correlación citogenética t(9;22) (BCR-ABL) KOR-SA+, CD66+, CD38 het / low, CD34 y CD10 hom, CD13+ 11q23 (MLL) Pro-B, CD15+, NG2+, My+ t(1;19) (E2A-PBX1) Pre-B t(12;21) (TEL-AML1) CD45-, CD20-, CD10+++, >DNA index

LMA. Correlación citogenética CBF-MYH11X CD34+, CD13+, CD2+ (31%) PML-RAR HLA-DR-, CD34-. CD15s- y CD13+ heterogéneo. Stop madurativo. PLZF- RAR CD56+ AML1-ETO CD19+, CD56+, CD34+++

Estudio Inicial de la Leucemia. CFM Paneles de anticuerpos monoclonales empleados para el estudio inicial de las LAs (FITC/ PE/ ECD/ PC5/ PC7) cMPO/ cCD79a/ CD45/ cCD3 nTdT/ cIgM/ CD45/ CD34 CD45/ CD4/ CD8/ CD3/ CD19 CD10/ CD20/ CD45/ CD34/ CD19 CD38/ CD22/ CD45/ HLADR/ CD19 CD15/ CD13/ CD45/ CD33/ CD19 KOR-SA/ 7.1/ CD45/ CD24/ CD19 IP (DNA)/ pan-B CD45/ CD4/CD8/ CD3/ CD19 CD7/ CD34/ CD3/ HLADR/ CD5 CD7/ CD1a/ CD45/ CD33/ CD56 CD7/ CD13/ CD45/ CD10/ CD2 CD38/ TCR/ CD45/ TCR/ CD3 LLA de fenotipo B LLA de fenotipo T INMUNOFENOTIPOS LEUCÉMICOS LMA CD15/ CD13/ CD45/ CD33/ CD34 CD7/ CD117/ CD45/ CD34/ CD56 CD65/ CD135/ CD45/ CD2/ CD34 CD64/ CD11b/ CD45/ CD14/ CD16 HLADR/ CD235a/ CD45/ CD34/ CD41

EMR en LLA infantil. Checkpoint Coustan-Smith E et al. Blood 2000 EMR POST-TRATAMIENTO DE INDUCCIÓN

EMR en LLA infantil. Checkpoint ESTUDIOS SECUENCIALES Van Dongen JJM et al. Lancet 1998 (n=129) Recaídas (3 a) Bajo Riesgo (EMR- en semanas 5 y 12) 2% Alto Riesgo (EMR  0,1% en semanas 5 y 12) 75% Riesgo Intermedio (EMR  0,1% en semanas 5 o 12) 23% Coustan-Smith E et al. Blood 2000 (n=195) (EMR  0,01%) Recaídas (4 a) Post-inducción EMR+ y Semana 14 EMR+ 68% Semana14 EMR- 7%

EMR en LLA infantil. Checkpoint Dworzak MN et al. Blood 2002 Alto Riesgo: EMR  0,1% en d. 33 y  0,01% en s. 12 EMR  10/ L en d. 33 y  1/ L en s. 12 DETERMINACIÓN SECUENCIAL

EMR en LLA de adultos. Checkpoint Vidriales MB et al. Blood 2003 EMR en el día 14 del tratamiento de inducción 0,5% RFS 16 m <0,5% RFS NR <0,03% RFS “extrapolada” a los 5 años de 90% EMR en el día 35 del tratamiento de inducción 0,05% RFS 17 m <0,05% RFS 42 m

EMR en LLA Infantil. Resultados EFS mediana (IC 95%) EMR < 0,02 na EMR  0,02 9  5 m mediana (IC 95%) EMR < 0,02 na EMR  0,02 6  5 m

EMR en LMA. Checkpoint San Miguel JF et al. Blood 2001 EMR después del tratamiento de Inducción

Checkpoint EMR en LMA. Venditti A et al. Blood 2000 EMR después del tratamiento de consolidación OS 0,035% 10m <0,035% nr RFS 0,035% 77% (7m) <0,035% 17% (nr) Buccisano F et al. Leukemia 2006 EMR después del tratamiento de consolidación (cutoff : 0,035%) Post-IND (pos) / Post-CONS (neg) = Post-IND (neg) / Post-CONS (neg)

EMR en LLA. Conclusiones La persistencia de EMR durante el tratamiento tiene un valor pronóstico adverso independiente de otras variables Cantidad de EMR significativa: Post-tratamiento de Inducción:  0,1% Durante el resto del tratamiento:  0,01% Muy mal pronóstico: Pacientes con EMR  1% post-Inducción EMR persistente Muy buen pronóstico: EMR- post-Inducción y post-Consolidación EMR- precozmente (d. 19)

EMR en LMA. Conclusiones La persistencia de EMR durante el tratamiento tiene un valor pronóstico adverso independiente de otras variables Muchas veces no es posible incluir a todas las células leucémicas en un solo IFL. Cantidad de EMR significativa: variable según estudios Post-tratamiento de Inducción:  0,1%,  0,5%, * Post-Consolidación:  0,2% ,  0,035% Muy mal pronóstico: Pacientes con EMR  1% post-Inducción (83% recaidas) Muy buen pronóstico: EMR- post-Inducción < 0,01%