Marcadores celulares: radioisótopos, cromóforos, fluoróforos y otros Métodos y Técnicas de Estudio en Biología Celular
Radioisótopos: principios generales Radioisótopos empleados en biomedicina: 3H, 14C, 13C, 32P, 33P, 35S , 125I, 131I, 24Na 1 dps = 1 Bq; 60 dpm = 1 Bq; 1 mCi = 37 kBq Eficiencia, E = cpm/dpm Técnicas: autoradiografía (histoquímica, electroforesis), centelleo líquido, contaje gamma, trazadores orgánicos (distribución y metabolización).
Propiedades de los radioisótopos 3H 14C 35S 32P 125I T1/2 12.3a* 5730a* 87.4d* 14.3d* 60d* Radiación b b b b g Penetración (aire) 6 mm 24 cm 30 cm 7,2 m > 10 m Escudo No 1 cm 1 cm 1 cm plomo 0.25 mm (13 mm para 131I) Actividad (Bq) 3·1010 9·108 4·109 1·108 1·107 Limite anual (MBq) 3000 90 80 10 1 *a=años, d=días
Cromóforos: la absorción
Ley de Beer-Lambert I = I0 · 10-e c l Log I0/I = A = e · c · l La densidad óptica (D.O.) es la absorción en us sistema en el que l = 1
Cromóforos
Cromóforos: el espectrofotómetro
Cromóforos intrínsecos Determinados grupos prostéticos de proteínas actúan como cromóforos intrínsecos. Su espectro característico sirve para identificar proteínas.
Cromóforos intrínsecos
Fluoróforos: excitación y emisión La molécula A es fluorescente, mientras B carece de fluorescencia. G denota el estado basal; S el primer estado excitado.
Esquema del fluorímetro (Formato en L) Prisma o filtro
Fluoróforos: ejemplos
Fluoróforos: Ejemplos
Ejemplo en microscopia de fluorescencia Medición con Fura-2 de la concentración de Ca2+ en célula de Purkinje.
Fluoróforos: Marcaje Marcaje de proteínas con anticuerpos fluorescentes. Ejemplo de marcaje con anticuerpos primarios y secundarios
Citometría de flujo La citometría de flujo es una técnica ampliamente utilizada para separar, clasificar, analizar e investigar las células
Fluorescencia en la fluidez de membrana Fluidez y difusión mediante FRAP (Fluorescence Recovery After Fotobleaching)
Fluorescencia e Interacción entre moléculas (FRET) FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Fluorescencia en la fluidez de membrana Estudio de la fluidez en híbridos ratón-humano Patching y capping en membranas de leucocitos
Otros métodos de marcaje Oro coloidal Biotina-Avidina Marcaje enzimático Esferas magnéticas Marcaje de Spin
Fluorescencia en la fluidez de membrana EJERCICIO: Describe un experimento en el que uno de los siguientes marcajes sea una buena elección: Marcaje de una proteína con 125I. Marcaje de una hormona con 3H.