Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC HPLC: High Performance Liquid Chromatography 1

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Definición: Técnica que realiza la separación de una mezcla de compuestos a través de la interacción selectiva entre los solutos, una fase estacionaria y una fase móvil, haciendo uso de instrumentación automatizada de alta eficiencia

Cromatografía en Columna Definición: Técnica de separación que se lleva a cabo en una columna empacada con un soporte (gel de sílice o alúmina) 3

Cromatografía en Columna Fase estacionaria: Silica gel (polar) Carbonato de calcio Almidón Alúmina (polar) Diámetro: 5 - 50 mm Longitud: 5 cm – 1 m Tamaño 40 - 63 μm. 63 – 200 μm.

Cromatografía en Columna Fase móvil: Solventes utilizados en cromatografía en capa fina funcionan adecuadamente. Serie eluotrópica Pentano Éter de petróleo Hexano Ciclohexano Tetracloruro de carbono Tolueno Xileno Benceno Cloroformo Acetona Acetato de etilo Acetonitrilo Iso-propanol Metanol Agua Rubinson & Rubison Química Analítica Contemporánea

Cromatografía en Columna Mecanismo de separación: K = CS/CM 6

Cromatografía en Columna Tipos de cromatografía en columna: Cromatografía de intercambio iónico, la fase estacionaria esta formada de aniones (-SO3-) o cationes (-N(NH3)3+). Los iones con carga opuesta son retenidos en la fase estacionaria por fuerzas electrostáticas. Cromatografía de exclusión molecular, efectúa la separación de acuerdo al tamaño de las moléculas. La columna esta rellena de un soporte cuyos poros son del tamaño similar al tamaño de las moléculas de la muestra. Las moléculas pequeñas quedan retenidas en los poros mientras que las grandes no, siendo las primeras en salir de la columna. Cromatografía de afinidad: Es técnica cromatográfica selectiva , se basa en las interacciones especificas entre una clase de moléculas y una segunda molécula que esta unida covalentmetne a la fase estacionaria, por ejemplo un anticuerpos unido a una proteína, si la muestra contiene una proteína afín a la enlazada esta reacionará con el anticuerpo y se fija a este, la cual será liberad al modificar el pH dela fase móvil. Intercambio Iónico Exclusión Molecular Afinidad 7

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC) Cromatografía en columna Desventajas de la cromatografía en columna Diámetro: 5 - 50 mm Longitud: 5 cm – 1 m Tamaño de partícula: 40 – 200 μm Grandes volúmenes de fase móvil Tiempos de análisis largos Gran tamaño de muestra La identificación y cuantificación por algún método no acoplado En cromatografía en columna la fase móvil se mueve por gravedad a través de la fase estacionaria, esto lleva a tiempos de análisis largos (horas) además las fracciones colectadas tienen que ser analizadas por algún método alargando así los tiempos de análisis. La mejor opción para reducir los tiempos de análisis es incrementar el flujo de la fase móvil ya sea por vacío o presión. Sin embargo esto lleva a perder eficiencia debido a que conforme se incrementa el flujo la altura del plato teórico se , reduciéndose el número de platos por columna. El 85 % de los compuesto son volátiles o semi-volátiles, para el resto es necesario encontrar otro método de separación. Aquí es donde entra la cromatografía de líquidos de alta resolución 8

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Antecedentes históricos 1952 Premio Nobel de Química par Martin y Synge por el desarrollo de cromatografía líquido-líquido 1959 Primer trabajo de exclusión molecular aplicado a biopolímeros polímeros por Flodin y Porath 1960 Separación de solutos iónicos . Ionizables y neutros 1970 La técnica de HPLC se difunde ampliamente, la instrumentación se mejora 1970-1980 Uso de modificadores de fase móvil para mejorar la eficiencia 1990 Se mejora la tecnología de fase reversa

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC) 1951 Martin y Synge: Sugieren que altas presiones de fase móvil y tamaño reducido de partículas puede mejorar notablemente la eficiencia en la cromatografía en columna. 10

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC) Instrumentación: Reservorio de fase móvil 11

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC) Reservorios de fase móvil Tubo de Teflón 1/8’’ Fase Móvil: Libre de partículas Filtrar en membranas de 0.45 12μm Libre de aire Recipiente de vidrio Filtro 12

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Instrumentación: Sistema de bombea 13

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC) Sistema de bombeo de fase móvil Es el sistema mediante el cual la fase móvil se introduce através de la columna Características: Resistente a los solventes Amplio intervalo de flujos Facilidad de cambiar un solvente por otro De fácil manejo y mantenimiento 14

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC) Sistema de bombeo de fase móvil Sistema de bombeo a presión constante Bomba Neumática Sistema de bombeo a flujo constante Bomba tipo jeringa Bomba reciproca 15 15

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC) Bomba neumática 10 bar 16 16

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC) Bomba tipo jeringa Volumen de la cámara: 200 – 500 cm3 17

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC) Bomba reciproca La bomba reciproca es el sistema mas usado en HPLC. En este sistema el pistón se mueve por medio de un cabezal excéntrico cuando el pistón se retrae mueve la válvula check permitiendo la entrada de fase móvil a la cámara de solvente, mientras que se cierra la válvula check que va a la columna. Este sistema tiene una capacidad ilimitada y su volumen interno puede ser reducido de 10 – 100 μl 18 18

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC) Bomba reciproca La bomba reciproca es el sistema mas usado en HPLC. En este sistema el pistón se mueve por medio de un cabezal excéntrico cuando el pistón se retrae mueve la válvula check permitiendo la entrada de fase móvil a la cámara de solvente, mientras que se cierra la válvula check que va a la columna. Este sistema tiene una capacidad ilimitada y su volumen interno puede ser reducido de 10 – 100 μl 19 19

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Instrumentación: Puerto de inyección 20

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Instrumentación: Puerto de inyección Válvula Rheodyne 21 21

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Características de la muestra Libre de partículas Filtrar en membranas de 0.45 μm 22 22

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Instrumentación: Puerto de inyección Diagrama de flujo válvula Rheodyne Loop de 10 -50 μl 23 23

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Instrumentación: Puerto de inyección Diagrama de flujo válvula Rheodyne 24 24

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Instrumentación: Columna 25

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Instrumentación: Columna Acero ( Cr-Ni-Mo) Relativamente inerte a la corrosión química Longitud: 10, 12.5 o 15 cm Diámetro: 4.6, 6.2 o 9 mm Soporte: 10, 5, 4 o 3 μm 26

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Instrumentación: Soporte Silica microporosa Permeable a solventes (fase estacionaria) Diámetros : 3 - 10 μm Área superficial: 500 m2/g Fases estacionaria enlazada covalentemente a la silica 27 27

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Instrumentación: Fase estacionaria Fase polar Fase no polar R= (CH2)3NH2 Amino R= (CH2)17CH3 Octadecilo R= (CH2)3C=N Ciano R= (CH2)7CH3 Octilo R= (CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH Diol R= (CH2)3C6H5 Fenilo 28 28

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Modo de separación Fase Normal Fase Reversa Polaridad fase estacionaria Alta Baja Polaridad fase móvil Baja- media Media- alta Típica fase móvil Heptano/CHCl3 CH3OH/H2O Orden de elusión 1º Menos polar 1º Mas polar 29 29

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Ventajas Fase normal Fase reversa Separación de mezclas con polaridades diversas Rápido equilibrio de la columna con la fase móvil Fácil, rápido y reproducible Picos menos coleados Se estabiliza rápidamente a cambios de fase móvil Reproducible 30 30

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Fase móvil 31 31

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Modalidades de separación + + - - Isocrático Gradiente por etapas + - Curvas de gradiente 32 32

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Modalidades de separación Isocrático Gradiente Elución de picos mas rápido, ahorro de tiempo de análisis, mayor productividad 33 33

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Efecto de la temperatura 34 34

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Efecto del tipo de fase estacionaria 35 35

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Efecto del flujo de fase móvil Los estudios de Martin y Synge en 1941, sientan las bases de la cormatografia de liquidos de lata resolución. de Ellosproponen introducir la fase móvil a presión así como reducir el tamaño de parrticula para conellos conseguir mejores eficiencias. Sin emabrga sus hayazgos fueron quedados en el olviado y reemplazdos por la CG, la cual evoluciona a grandes zancadas y no fue hasta que esta quedo bien establecida que se retomo la cromatografia de liquidos. 36 36

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Efecto del pH Los estudios de Martin y Synge en 1941, sientan las bases de la cormatografia de liquidos de lata resolución. de Ellosproponen introducir la fase móvil a presión así como reducir el tamaño de parrticula para conellos conseguir mejores eficiencias. Sin emabrga sus hayazgos fueron quedados en el olviado y reemplazdos por la CG, la cual evoluciona a grandes zancadas y no fue hasta que esta quedo bien establecida que se retomo la cromatografia de liquidos. 37 37

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Efecto del fase móvil 38 38

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Detectores 39 39

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC 40 40

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Tipo Respuesta Rango lineal Detecta UV/Vis Arreglo de diodos Selectivo 10-4 -10-5 Enlaces C-O, aromáticos, alquenos Florescencia 10-3 – 10-4 Hidrocarburos policíclicos Conductividad NO3-, NO2-, SO42-, Cl- Índice de refracción Universal Ácidos orgánicos, azúcares 41 41

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC 42 42

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Celda 43 43

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Los estudios de Martin y Synge en 1941, sientan las bases de la cormatografia de liquidos de lata resolución. de Ellosproponen introducir la fase móvil a presión así como reducir el tamaño de parrticula para conellos conseguir mejores eficiencias. Sin emabrga sus hayazgos fueron quedados en el olviado y reemplazdos por la CG, la cual evoluciona a grandes zancadas y no fue hasta que esta quedo bien establecida que se retomo la cromatografia de liquidos. 44 44

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Los estudios de Martin y Synge en 1941, sientan las bases de la cormatografia de liquidos de lata resolución. de Ellosproponen introducir la fase móvil a presión así como reducir el tamaño de parrticula para conellos conseguir mejores eficiencias. Sin emabrga sus hayazgos fueron quedados en el olviado y reemplazdos por la CG, la cual evoluciona a grandes zancadas y no fue hasta que esta quedo bien establecida que se retomo la cromatografia de liquidos. 45 45

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC 46 46

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC 47 47

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Los estudios de Martin y Synge en 1941, sientan las bases de la cormatografia de liquidos de lata resolución. de Ellosproponen introducir la fase móvil a presión así como reducir el tamaño de parrticula para conellos conseguir mejores eficiencias. Sin emabrga sus hayazgos fueron quedados en el olviado y reemplazdos por la CG, la cual evoluciona a grandes zancadas y no fue hasta que esta quedo bien establecida que se retomo la cromatografia de liquidos. 48 48

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC 49 49

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC 50 50

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC 51 51

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC 52 52

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Aniones Los estudios de Martin y Synge en 1941, sientan las bases de la cormatografia de liquidos de lata resolución. de Ellosproponen introducir la fase móvil a presión así como reducir el tamaño de parrticula para conellos conseguir mejores eficiencias. Sin emabrga sus hayazgos fueron quedados en el olviado y reemplazdos por la CG, la cual evoluciona a grandes zancadas y no fue hasta que esta quedo bien establecida que se retomo la cromatografia de liquidos. 53 53

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC 54 54