Análisis metilómico prenatal no invasivo mediante secuenciación hologenómica por bisulfito del ADN en plasma materno F.M.F. Lun, R.W.K. Chiu, K. Sun, T.Y. Leung, P. Jiang, K.C.A. Chan, H. Sun e Y.M.D. Lo Noviembre de 2013 www.clinchem.org/content/59/11/1583.full © Copyright 2013 by the American Association for Clinical Chemistry

Introducción Epigenética Metilación del ADN Hace referencia a los mecanismos celulares y biológicos que alteran la expresión genética o la función de la expresión del ADN sin cambiar la secuencia del ADN. Los ejemplos de mecanismos epigenéticos incluyen metilación del ADN, modificaciones de histonas, remodelación de cromatinas y ARN no codificantes. Metilación del ADN Es uno de los fenómenos epigenéticos estudiados con mayor frecuencia y se presenta principalmente en forma de metilación de citosinas. Esto hace referencia a la inserción de un grupo metílico al carbono 5' de los residuos de citosina en dinucleótidos CpG.

Introducción Metilación del ADN y desarrollo La metilación del ADN desempeña una función en el control de la expresión genética, la función activadora del gen, la inactivación del cromosoma X y el sellado genómico. Los investigadores presentan gran interés en el estudio de la función de la metilación del ADN en el crecimiento fetal y el desarrollo así como los patrones de metilación atípica en relación con las patologías fetales o relacionadas con el embarazo. Sin embargo, no puede obtenerse acceso con facilidad a los tejidos fetales o placentarios de embarazos viables antes del término.

Introducción ADN fetal libre de células circulante Durante el embarazo, el ADN principalmente de células placentarias mortecinas se liberan a la sangre de la madre. Tales moléculas de ADN fetal se encuentran en un contexto de mayor concentración de ADN de la madre en plasma materno. Las moléculas de ADN fetal circulante presentan una naturaleza libre de células y de fragmentos cortos. Por lo tanto, el ADN fetal libre de células constituye una fuente de material genético fetal del que se podía obtener una muestra de forma no invasiva a través de la obtención de una muestra de sangre de la madre.

Pregunta Ha habido un gran número de trabajos sobre el estudio del perfil de metilación del ADN en tejidos placentarios. ¿Qué han descubierto los investigadores hasta el momento? ¿Qué impacto tienen las anomalías en la metilación del ADN sobre el desarrollo del embarazo, el feto y la descendencia?

Materiales y métodos Análisis metilómico fetal y placentario no invasivo Las muestras de sangre periférica se obtuvieron a partir de una mujer embarazada en el primer trimestre, el tercer trimestre y luego del parto. El ADN en plasma materno se sometió a la secuenciación masiva en paralelo por bisulfito. Se aplicaron procedimientos bioinformáticos para distinguir los perfiles de metilación fetal y placentario de aquellos del contexto del ADN materno.

Pregunta Describa los dos diferentes métodos usados en este estudio para determinar el perfil de metilación fetal/placentario del plasma materno a pesar de la presencia del amplio contexto del ADN materno.

Materiales y métodos Detección de trisomía 21 mediante secuenciación por bisulfito de ADN en plasma Las muestras de sangre periférica se obtuvieron a partir de una mujer embarazada que se presentó para realizarse un examen de detección de síndrome de Down prenatal. El ADN en plasma materno se sometió a la secuenciación masiva en paralelo por bisulfito. La densidad de metilación de las moléculas de ADN en plasma con origen en el cromosoma 21 se normalizó por las densidades de metilación de los demás cromosomas.

Resultados Elaboración de perfiles hologenómicos no invasivos del metiloma placentario El análisis del plasma materno permitió la determinación correcta del perfil de metilación del tejido placentario de forma hologenómica. La naturaleza no invasiva de este método permitió la supervisión en serie de los cambios en el perfil de metilación del tejido placentario durante todo el embarazo como se indicó en el embarazo estudiado. Se demostró la hipometilación del ADN placentario.

muestras del tercer trimestre Perfil de metilación hologenómico de las muestras del tercer trimestre Figura 1. Gráficos de círculos de densidad de metilación por depósito de 1 Mb. Los ideogramas de cromosomas (anillo más externo) están orientados pter-qter en sentido horario (los centrómeros se muestran en rojo). El segundo tramo más externo muestra la cantidad de localizaciones de CpG en las regiones de 1 Mb correspondientes, hasta 20,000 localizaciones. Las densidades de metilación de las regiones de 1 Mb correspondientes se muestran en los demás tramos de acuerdo con el esquema de colores presentado en el centro. Del interior al exterior: muestra de vellosidad coriónica, lecturas específicas del feto en plasma materno, lecturas compartidas en plasma materno, lecturas fetales y no fetales combinadas en plasma materno, y células sanguíneas maternas.

Resultados Aplicaciones El estudio además demuestra que los datos posibilitaron la evaluación no invasiva de la trisomía 21, el estado del sellado de los genes, los cambios que dependen de la edad gestacional en la metilación del ADN de locus genéticos, la relación entre la metilación del ADN y el tamaño de los fragmentos del ADN en plasma, y la detección no invasiva de marcadores de metilación específicos del tejido placentario. En el comentario editorial que acompaña el artículo se describen otras posibles aplicaciones.

Densidades normalizadas de metilación del comosoma 21 Euploide Trisomía 21 Figura 2. Detección de trisomía 21. Gráfico de las densidades normalizadas de metilación del cromosoma 21 a partir de muestras de plasma materno obtenidas en embarazos euploides y con trisomía 21.

Primer trimestre Tercer trimestre Locus hipermetiladosa Locus hipermetiladosb Locus hipermetiladosa Locus hipermetiladosb Locus previstos, n 3081 44 455 1746 14 930 Locus con densidades de metilación > 40 % en el tejido placentario, nc 1678 N/Ad 1525 N/A Locus con densidades de metilación < 60% en el tejido placentario, nc N/Ae 23 468 N/Ae 13 475 Locus superpuestos con las DMR extraídas del tejido placentarioc y las células sanguíneas maternas, n 1457 21 812 1279 12 677 aLocus en los cuales la placenta presenta una hipermetilación ≥ 20 % en comparación con las células sanguíneas maternas. La búsqueda de locus hipermetilados comenzó por la lista de locus con densidades de metilación de < 20 % en células sanguíneas maternas. bLocus en los cuales la placenta presenta una hipermetilación ≥ 20 % en comparación con las células sanguíneas maternas. La búsqueda de locus hipometilados comenzó por la lista de locus con densidades de metilación de > 80% en células sanguíneas maternas. cLos datos de secuenciación por bisulfito de las MVC y el tejido placentario a término se usaron para verificar los datos de plasma materno del primer trimestre y del tercer trimestre, respectivamente. dNo se aplica a la búsqueda de locus hipometilados. eNo se aplica a la búsqueda de locus hipermetilados. Tabla 2. Cifras de locus metilados de forma diferenciada en tejido placentario previstos a partir de los datos de secuenciación del ADN en plasma materno.

Metilación (%) Longitud del fragmento de ADN (bp) Figura 3. Densidades de metilación y tamaños de moléculas de ADN en plasma. Plasma materno del primer trimestre. Los datos de todas las lecturas de secuenciación que abarcaron al menos una localización de CpG están representados con la curva azul. Los datos de las lecturas que también incluyeron un alelo del SNP específico del feto están representados con la curva roja. Los datos de las lecturas que también incluyeron un alelo del SNP específico de la madre están representados con la curva verde.

Pregunta ¿Qué otras aplicaciones se podrían explorar con las metodologías desarrolladas en este estudio?

Editorial acompañante: Oudejans C.B.M. Maternal Plasma Bisulfite DNA Sequencing: Tomorrow Starts Today. (Plasma materno. Secuenciación de ADN por bisulfito: el mañana empieza hoy). Clinical Chemistry 2013;59:1547-9.

Gracias por su participación en el Clinical Chemistry Journal Club de este mes. Podrá encontrar otros Journal Club en www.clinchem.org ¡Descargue en forma gratuita la aplicación de Clinical Chemistry en iTunes para obtener contenido adicional! Síganos en