SOLUBILIZACIÓN o EXTRACCIÓN DE LA MOLÉCULA DE INTERÉS SEPARACIÓN DE BIOMOLÉCULAS AISLAMIENTO PURIFICACIÓN CARACTERIZACIÓN PRIMER PASO: SOLUBILIZACIÓN o EXTRACCIÓN DE LA MOLÉCULA DE INTERÉS RUPTURA MECÁNICA *trituración *homogeneizador *uso de Prensa French *Sonicador

Estrategia general de purificación Solubilidad SALTING IN SALTING OUT Carga Iónica Cromatografía de Intercambio Iónico Electroforesis Isoelectroenfoque Polaridad Cromatografía de adsorción Cromatografía en papel Cromatografía de interacción hidrofóbica Tamaño Molecular Diálisis Electroforesis en gel Cromatografía de filtración por geles Ultracentrifugación Especificidad de unión Cromatografía de afinidad

La solubilidad de las proteínas depende de la concentración de sales disueltas, la polaridad del solvente, el pH y la temperatura

SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS chroma color graphein escribir La mezcla de sustancias a fraccionar se disuelven en un fluído líquido o gaseoso denominado FASE MÓVIL. La solución resultante se filtra a través de una matriz sólida porosa denominada FASE ESTACIONARIA

R+A- + B- R+B- + A- Cromatografía de intercambio iónico Los iones unidos en forma electrostática a una matríz insoluble y químicamente inerte se reemplazan de manera reversible por los iones de la solución R+A- + B- R+B- + A-

Cromatografía de exclusión molecular

Polaridad Cromatografía de adsorción Cromatografía en papel

Cromatografía de afinidad affinity chromatography a. ligand based - glutathione and GST covalent linking of ligand to resin figure 6-13 and 6-14 Affinity Chromatography This is the most selective type of chromatography employed. It utilizes the specific interaction between one kind of solute molecule and a second molecule that is immobilized on a stationary phase. For example, the immobilized molecule may be an antibody to some specific protein. When solute containing a mixture of proteins are passed by this molecule, only the specific protein is reacted to this antibody, binding it to the stationary phase. This protein is later extracted by changing the ionic strength or pH.

La migración es proporcional a su densidad de carga, tamaño y forma ELECTROFORESIS Migración de iones en un campo eléctrico La migración es proporcional a su densidad de carga, tamaño y forma MATRICES USADAS AGAROSA POLIACRILAMIDA

PROTEÍNA AISLADA ENSAYO ESPECÌFICO Enzima: medición de la velocidad de formación de un producto es proporcional a la cantidad de enzima presente REACCIONES COLOREADAS, FLUORESCENTES O REACCIONES ACOPLADAS Proteínas (no enzimas): procedimientos inmunoquímicos (RIA, ELISA, WESTERN BLOT)

Fsedimentación= mw2r-Vprw2r ULTRACENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE Fsedimentación= mw2r-Vprw2r m masa velocidad angular r distancia de un punto Vp volumen de la partícula Densidad de la solución

Fsedimentación= Ffricción S= v = M (1- Vp ) w2r Nf Cuando Fsedimentación= Ffricción S= v = M (1- Vp ) w2r Nf donde s es el coeficiente de sedimentación Por lo tanto, la masa de una partícula puede determinarse a partir de su coeficiente de sedimentación m= M/N