Los HMM son modelos probabilísticos de una secuencia

HMM = cadena de Markov + modelo multinomial

Cada posición de la cadena de Markov está en un estado oculto

Aplicaciones biológicas de los HMM Segmentation: Gene and protein sequences may contain distinct regions whose chemical properties differ widely. HMMs can help us to define the exact boundaries of these regions. Multiple alignment: From a MSA, a so-called profile HMM can be defined against which all new sequences can be aligned. These profile HMMs also make it possible to assign protein function quickly, and can be regarded both as a summary of a MSA and as a model for a family of sequences. Prediction of function: HMMs allow us to make probabilistic statements about the function of proteins, or let us assign proteins to families of unknown function. Gene finding: If we wish to find eukaryotic genes or pseudogenes we require the flexibility of HMMs. Aplicaciones biológicas de los HMM

Probabilidades de transición y de emisión

Los parámetros que definen un HMM

Ejemplo 1: el casino de Nuncaganarás Probabilidades de transición Probabilidades de emisión Ejemplo 1: el casino de Nuncaganarás

Conociendo las probabilidades de emisión y de transición se puede determinar la secuencia más probable de motivos ocultos que ha originado la secuencia observada, es decir, qué dado se ha utilizado en cada tirada Los estados ocultos

Nature Biotechnology 22 (2004): 1315-1316

Ejemplo 2: separación de exones e intrones

Los estados ocultos más probables: el algoritmo de Viterbi

La secuencia más probable : el algoritmo de avance

Perfiles HMM

A partir de un AMS se puede obtener un perfil HMM

AMS El problema de las expresiones regulares Expresión regular: [AT]-[CG]-[AC]-[ACTG]*-A-[TG]-[GC] Secuencia consenso Secuencia muy improbable ACAC - - ATC TGCT - - AGG El problema de las expresiones regulares

Los recuadros contienen las probabilidades de emisión de cada estado A partir del AMS se calculan las probabilidades de transición y de emisión del modelo Hay dos estados posibles: estado principal y estado de inserción (enmarcado en rojo) Los recuadros contienen las probabilidades de emisión de cada estado Las flechas indican las probabilidades de transición de un estado a otro Modelo de Markov oculto obtenido a partir del AMS

HMM = Modelo probabilístico El HMM permite calcular la probabilidad de que una secuencia determinada se ajuste al modelo HMM = Modelo probabilístico

HMM = Sistema de puntuación El HMM permite otorgar una puntuación (que, en realidad, es una probabilidad) a cada secuencia, en función de lo bien o mal que se ajustan al modelo La secuencia excepcional es 2000 veces más improbable que la secuencia consenso HMM = Sistema de puntuación

Log odds = logaritmo del cociente de probabilidades La probabilidad no es la mejor forma de reflejar la puntuación porque depende en gran medida de la longitud de la secuencia. Es mejor usar el log odds. Odds = Probabilidad de que la secuencia S se ajuste al HMM Probabilidad de que S se deba al simple azar (null model) Log odds = logaritmo del cociente de probabilidades

Log odds score: los logaritmos se suman (no se multiplican) Las probabilidades de emisión del HMM se convierten en log odds Las probabilidades de transición se convierten en logaritmos Log odds score: los logaritmos se suman (no se multiplican)

Log odds score vs. probabilidades Cuando una secuencia se ajusta al modelo, su log-odds score es elevado. Cuando el modelo neutro (null model) es mejor, el log-odds es negativo. Según el cálculo de probabilidades, la secuencia original nº 2 y la secuencia excepcional tienen una puntuación parecida. Sin embargo, el log odds de la secuencia original del alineamiento es mucho mayor. El log odds tiene mayor poder discriminatorio. Log odds score vs. probabilidades

Los perfiles HMM permiten caracterizar una familia de proteínas

Un perfil HMM se construye a partir de un AMS

Los distintos estados (ocultos) de un perfil HMM Begin End Estados obligatorios que marcan el inicio y el final del modelo (no emiten caracteres) Estados principales (uno por cada columna de la secuencia ancestral). Cada estado tiene unas probabilidades de emisión distintas. Estados de inserción que introducen caracteres en el alineamiento (tiene sus propias probabilidades de emisión ) Estados de eliminación que permiten saltar de una posición del alineamiento a otra (no emiten caracteres) Los distintos estados (ocultos) de un perfil HMM

Transiciones de un estado oculto a otro Secuencia similar a la ancestral (ADGK) Secuencia con dos huecos en el medio Secuencia con un hueco al final Secuencia con dos inserciones en el medio Transiciones de un estado oculto a otro

Cálculo de las probabilidades de emisión y de transición Para construir el perfil HMM hay que determinar las probabilidades de emisión de cada estado y las probabilidades de transición de un estado a otro. Como estos datos no se conocen, hay que estimarlos a partir de un AMS. Lo ideal es partir de un AMS que incluya entre 20 y 100 secuencias homólogas. Cálculo de las probabilidades de emisión y de transición

Alineamiento de 30 secuencias (dominio SH3) Main to delete transition Begin to delete transition Insert to main transition Main to insert transition Main state (1-6) Indel state Main state (7-14) Alineamiento de 30 secuencias (dominio SH3)

Estado principal (posiciones 1-6) Estado principal (posiciones 7-14) Indel state Estado principal (posiciones 7-14) Perfil HMM correspondiente al alineamiento anterior

Para evitar multiplicar por cero (o el logaritmo de cero) se añaden pseudocuentas a las probabilidades de emisión de cada estado principal En el perfil HMM hay muchos aminoácidos que no están representados (Paa=0) Pseudocuentas (1)

Una forma de añadir pseudocuentas es sumar 1 a todos los aminoácidos en todas las columnas También se puede añadir a cada aminoácido un número de pseudocuentas que sea proporcional a su abundancia relativa. También se puede añadir a cada aminoácido un número de pseudocuentas calculado teniendo en cuenta las sustituciones más probables en cada posición de la columna (para ello se utiliza una matriz de sustitución como PAM-50 o BLOSUM-62. Pseudocuentas (2)

Búsquedas en BD con un perfil HMM

Puntuación del alineamiento: Algoritmos de Viterbi y de avance

Distribución de los resultados tras una búsqueda en una BD

1.- Realiza AMS tan buenos o mejores que otros métodos 2.- Para hacer AMS no hay que ordenar las secuencias 3.- Es un método sólidamente basado en la teoría de probabilidad 4.- No hace falta estimar la penalización por indels 5.- Puede incluir información obtenida experimentalmente: * Longitud de la secuencia * Número, longitud y posición de los indels * Las frecuencias de los aminoácidos en cada posición Ventajas de los HMM

Inconvenientes de los HMM (1) 1.- Hay que estimar un número muy elevado de parámetros: * Longitud de la secuencia * Número, longitud y posición de los indels * Las frecuencias de los aminoácidos en cada posición * La probabilidad asociada a cada transición de un estado a otro Por tanto, hace falta: - un número elevado de secuencias (más de 50) para que el modelo “se entrene” y sea capaz de calcularlos - Una estimación inicial de todos esos parámetros (prior conditions) para comenzar el ciclo de iteraciones Cuanto mejor sea la estimación inicial, menor será el número de secuencias necesarias para entrenar el modelo Inconvenientes de los HMM (1)

Inconvenientes de los HMM (2) 2.- Es peligroso estimar la distribución de probabilidades de los aminoácidos (aa) a partir de unas pocas secuencias. Para evitar sacar conclusiones importantes a partir de un escaso número de observaciones, se recurre a las pseudocuentas: se aumenta de forma artificial el número de veces que se observa cada aa en cada columna. Hay varias formas de añadir pseudocuentas: * Añadir uno a todos los aa (implica que todos pueden presentarse con la misma probabilidad) * Añadir a cada aa un número proporcional a la frecuencia observada (se admite que no todos los aa aparecen con la misma frecuencia) * Añadir a cada aa un número de cuentas que refleje la información contenida en una matriz de sustitución (PAM, BLOSUM) Inconvenientes de los HMM (2)

Inconvenientes de los HMM (3) 3.- Es importante que el modelo no sólo refleje las características de las secuencias iniciales, sino también las variaciones que puedan presentar otros miembros de la familia. Si no, será un modelo “superentrenado” que sólo será capaz de reconocer a las secuencias iniciales. Para evitarlo se recurre a un proceso denominado regularización: Se parte de una distribución de aa cuidadosamente diseñada (mezclas Dirichlet), que se va modificando a medida que el modelo “se entrena”. Así se genera un modelo más representativo de la familia de proteínas a la que pertenece el conjunto inicial de secuencias porque admite un grado razonable de variaciones que se puedan presentar en secuencias relacionadas. Inconvenientes de los HMM (3)

Inconvenientes de los HMM (4) 4.- A medida que el modelo se entrena y se va ajustando a las secuencias iniciales, es posible que el proceso quede “atrapado” en una solución que se limita a un alineamiento óptimo local en vez de a uno global. Este problema se puede evitar mediante métodos que inyectan “ruido estadístico” al sistema, como el simulated annealing: En cada ciclo se genera un número de secuencias definido por el usuario y las cuentas (las veces que aparece cada aa en cada posición) se añaden a las de las secuencias iniciales. El ruido generado por este procedimiento disminuye a medida que aumenta el número de ciclos. Inconvenientes de los HMM (4)

Aplicaciones de los HMM

¿Para qué sirven los HMM? 1.- Para predecir la estructura secundaria de proteínas 2.- Para predecir secuencias señal en proteínas 3.- Para hacer alineamientos múltiples de secuencias (AMS) 4.- Para mejorar AMS obtenidos mediante otros métodos 5.- Para analizar secuencias y generar perfiles HMM característicos de una familia de proteínas 6.- Para buscar en las BD más miembros de una familia 7.- Para predecir genes (predice promotores, los lugares de unión al ribosoma, los ORF, regiones codificantes y no codificantes, las fronteras intrón/exón, etc.) ¿Para qué sirven los HMM?

Predicción de genes mediante HMM (la teoría)

Predicción de genes mediante HMM (la realidad)

Predicción de genes eucariotas usando HMM http://genes.mit.edu/GENSCAN.html Predicción de genes eucariotas usando HMM

Predicción de genes

Predicción de genes eucariotas usando HMM http://opal.biology.gatech.edu/eukhmm.cgi Predicción de genes eucariotas usando HMM

Predicción de la estructura secundaria de proteínas http://compbio.soe.ucsc.edu/SAM_T08/T08-query.html Introduce una dirección de E-mail Introduce una secuencia proteica en formato FASTA Predicción de la estructura secundaria de proteínas

Predicción de hélices transmembrana usando HMM http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/ Predicción de hélices transmembrana usando HMM

Predicción de hélices transmembrana usando HMM http://www.enzim.hu/hmmtop/ Predicción de hélices transmembrana usando HMM

Búsquedas en BD basadas en HMM http://hmmer.janelia.org/ Búsquedas en BD basadas en HMM

Software para construir HMM http://compbio.soe.ucsc.edu/sam.html Software para construir HMM

Software para construir HMM http://pgfe.umassmed.edu/meme/metameme-intro.html Software para construir HMM