Neisseria Moraxella Haemophilus

CARACTERISTICAS GENERALES Diplococos Gram negativos arriñonados, 0,6-1,5 um. N.elongata y K.denitrificans son cocobacilos Gram negativos o diplobacilos Inmóviles, no esporulados En general tienen requerimientos nutricionales Crecimiento mejorado por CO2 (especialmente N.gonorrhoeae) y humedad Metabolismo oxidativo (NO FERMENTATIVO)

HABITAT La mayoria son flora normal orofaríngea (ocasionalmente pueden encontrarse en otras mucosas) N.meningitidis y N.gonorrhoeae son patógenos primarios para el hombre. N.meningitidis puede colonizar mucosa orofaringea, nasofaringea y anogenital en portadores sanos

DIFERENCIACION DE GENEROS MORFOLOGIA CATALASA AC.DE GLUCOSA OXIDASA Neisseria Diplococo + V Branhamella - Moraxella Bacilos Kingella Cocobacilos

IDENTIFICACION DE Neisseria PRESUNTIVA DEFINITIVA Gram Oxidac. Hidratos C Oxidasa NO3 DNAsa Produc. exopolisac Crecim. en TYM Superoxol Resist. A colistin

Diplococos Gram negativos intra y extracelulares

UTILIZACION DE HIDRATOS DE CARBONO CTA (1% de azúcar) No recomendado para Neisserias (metabolismo oxidativo) Ataque de peptonas enmascar acidez Métodos rápidos Quad Ferm (Biomerieux)

OTRAS PRUEBAS IMPORTANTES Reducción de nitratos Diferencia N.gonorrhoeae (-) de K.denitrificans y B.catarrhalis (+). Resistencia a Colistin Diferencia N.gonorrhoeae, N.meningitidis y N.lactamica de otras Neisserias Superoxol (H2O2 30%) Diferencia a N.gonorrhoeae y N.meningitidis, B.catarrhalis de otras especies DNAsa Caracteriza a B.catarrhalis

PROBLEMAS EN LA IDENTIFICACION Cepas de N.cinerea, N.lactamica y N.polysaccharea aisladas en Thayer Martin de endocervix, recto, conjuntiva, linfadenitis han sido confundidas con N.gonorrhoeae. Cepas de N.gonorrhoeae que fallan en producir acidez de glucosa han sido confundidas con N.cinerea. Cepas de N.meningitidis con fallas en producir acido de maltosa han sido confundidas con N.gonorrhoeae

N. gonorrhoeae

CARACTERISTICAS GENERALES Altamente sensible a condiciones ambientales adversas (no sobrevive fuera del huesped mucho tiempo) Tendencia a la autólisis Transmitido por contacto directo Hombre a mujer (50-60% de eficacia con un solo contacto) Mujer a hombre (35% con un contacto) Neonatos: en el momento del parto Niños mayores: abuso sexual

FACTORES DE VIRULENCIA LPS: adherencia y unión bacteriana PG: citotóxico, activa complemento Pili: adherencia a mucosas Proteínas: Por (pasaje de sustancias) Opa (adherencia a mucosas) Rmp (poca variabilidad) Producción IgA proteasa

MANIFESTACIONES CLINICAS Paciente No complicada Complicada Hombre Uretritis Prostatitis Faringitis Epididimitis Proctitis Vesiculitis seminal Conjuntivitis DGI Mujer Cervicitis Endometritis Faringitis Salpingitis Proctitis PID Bartolinitis Perihepatitis Uretritis DGI Neonato Conjuntivitis Sepsis neonatal (DGI: sepsis, artritis, dermatitis, endocarditis, meningitis)

OFTALMÍA EN ADULTO

ARTRITIS GONOCÓSICA

TOMA DE MUESTRA Procedimiento > 2hs de última micción Introducir ansa o hisopo 2 – 3 cm dentro de la uretra Girar 5-10 seg.

TOMA DE MUESTRAS Hombre Mujer heterosexual Uretra (faringe), 1º chorro homosexual Uretra, anorectal, faringe. Endocervix (uretra, 1ºchorro, Bartolino, anorectal, faringe) DG: Sangre, genital (anorectal, faringe, articular, piel) Neonatos Conjuntiva (faringe, sangre) Niños Uretra, vagina, recto, faringe. (?) Hombre Mujer

TOMA DE MUESTRA Procedimiento No usar antisépticos, analgésicos y lubricantes. Limpiar exceso de moco Introducir el hisopo 2 cm dentro del cervix Girar 5-10 seg

MEDIOS DE TRANSPORTE PARA NG Optimo: Cultivo inmediato.  M. transp. no nutritivos: 12 hs max. 24hs: Stuart, Amies  M. de transp. nutritivos: 48 - 72 hs: Jembec, Transgrow, placa TM en lata / vela.

Transporte comercial

GRAM DIRECTO Preferible con ansa o hisopo seco (no en medio transp.) No grueso (gota) ni frotado: Leucocitos enteros y buena decoloración Sensibilidad muy buena en formas sintomáticas. Uretritis masculina: 95-98 % Oftalmía neonatos ca. 100 % Mujeres endocervical 50-75 % Rectal muy difícil Faríngea imposible (otras Neisseria spp.)

COLORACIÓN AZUL DE METILENO

Gram directo Diplococos Gram negativos Intra y extracelulares

CONDICIONES DE INCUBACIÓN 5 % CO2 (Cr1tico) Humedad (Crítico) 36 º C (NO >37) 24 – 72 hs

MEDIOS DE CULTIVO Medios Selectivos (TM, ML, NY) agar base GC + Hb + suplemento vitamínico + antibióticos Medios de Enriquecimiento: chocolate preferiblemente suplementado Medio para ATB y CIM: agar base GC + suplemento (no lleva Hb) Suplementos: Enfriar el medio a 50-60 C antes de agregarlos  Comerciales (Isovitalex, Polyvitex, Britalex, suplem.B)

DETECCION DE ANTIGENOS DE MUESTRA DIRECTA ELISA (GONOZYME, ABBOTT) Reacciones cruzadas con otras Neisserias NUCLEIC ACID PROBE TES (PACE, GEN PROBE) Quimioluminiscencia

POSIBLES ERRORES EN EL DIAGNOSTICO CULTURAL NG MATERIAL DE VIDRIO: Enjuague (detergentes) MEDIO DE CULTIVO: Agar base inadecuado (preferir GC, Columbia) toxicidad (almidón 1g/L) buferar (KHPO4 4 g/L, KH2PO4 1 g/L) Ph 7.2 Autoclave (oversterilized, almidón) Escasos nutrientes (Hb, supl), temperatura Concentración antibióticos (vancomicina), temp. Espesor de placa (10 ml mínimo y 25 ml ATB). Control esterilidad. Almacenaje. ESPECIMEN: Hisopos tóxicos (usar his. atóxicos, dacron, alginato) Muestra inadecuada (lugar) incorrecta (técnica) SIEMBRA: Demora. Mala técnica (1/3 placa y reaislar) INCUBACION: 35C (37C límite máximo) 3-5 % CO2 (mal cierre) Falta de humedad (humedecer algodón, papel)

Otros aspectos a tener en cuenta Cepas sensibles a vancomicina o a trimetoprima Acompañar de ACH al medio selectivo Algunas cepas pueden no crecer en AS No utilizar velas de colores Chequear que la lata no tenga agujeros en el fondo por oxidación Puede haber localizaciones genitales de N.meningitdis Utilizar azúcares de calidad analítica Cepas de N.meningitidis pueden ser maltosa (-) Revelar la prueba de polisacárido dentro de las 48 hs para evitar falsos negativos Son inhibidos por SPS

ANTIBIOTICOS UTILES PENICILINA, AMPICILINA (NO FRENTE A BLASA +). CEFTRIAXONA-CEFIXIMA CIPROFLOXACINA AZITROMICINA ESPECTINOMICINA TETRACICLINA

RESISTENCIA ANTIBIOTICA PENICILINA BLASA (20%) CROMOSOMICA (1%) TETRACICLINA (28%) EFLUJO PROTECCION RIBOSOMAL QUINOLONAS FLUORADAS (0,9%) CROMOSOMICA ALTERACION SITIO BLANCO

Neisseria meningitidis

CARACTERISTICAS GENERALES Aisladas de orofaringe de portadores en 5-15%. No sobrevive en medio ambiente Transmisión por contacto directo o gotas de flugge Excepcional transmisón sexual y portación ano-genital en homosexuales

ESTRUCTURA ANTIGENICA Antígeno capsular Lipopolisacárido Antígeno proteico de membrana externa FACTORES DE VIRULENCIA Endotoxina Cápsula Pili

MENINGITIS BACTERIANA PATOGENESIS Y FISIOPATOLOGIA COLONIZACION NASOFARINGEA INVASION LOCAL BACTERIEMIA INVASION MENINGEA REPLICACION BACTERIANA EN E.S.A. LIBERACION DE COMPONENTES BACTERIANOS( Pared celular L.P.S). END. MICROVASCULAR MACROFAGOS CEREBRAL

ANTIGENOS CAPSULARES A, B, C, D, 29E, H, I K, L, W135, X, Y,Z. Enfermedad epidémica: A, C. Esporádica e interepidemia (ocasionalmente epidémica): B

Neisseria meningitidis MENINGITIS DISTRIBUCION SEGÚN EDAD Neisseria meningitidis Argentina 2001 sobre 1308 casos con etiologías definidas

FACTORES DE RIESGO PARA INFECCIONES RECURRENTES DEFICIT DEL COMPLEMENTO C6 C7 C8 C9

INFECCIONES ASOCIADAS Meningitis Meningococcemia sin meningitis Artritis Poco frecuentes Conjuntivitis Sinusitis Endocarditis Neumonía EPI

MUESTRAS LCR HEMOCULTIVO PUNCION-BIOPSIA DE PETEQUIAS LIQUIDO ARTICULAR HISOPADO NASOFARINGEO OTRAS MUESTRAS

Neisseria meningitidis MENINGITIS ETIOLOGIA Neisseria meningitidis

DEMORA EN EL PROCESAMIENTO DEL LCR? SIEMBRA EN FRASCOS DE HEMOCULTIVO (PREFERENTEMENTE SIN SPS) Y PREPARACION DE UNA IMPRONTA PARA EXAMEN DIRECTO.

DETECCION DE ANTIGENOS CAPSULARES EN SUERO, LCR, ORINA COAGLUTINACION ELISA LATEX CIEF Utilidad principalmente frente a pacientes tratados previamente con ATB

SENSIBILIDAD DISMINUIDA A PENICILINA Alteración de PLP 2 Litvik y cols (93-99) N= 254 (pedi0tricos y adultos) 61% Serogrupo C (84%) y W135 (1,6%) Callejo y cols (94-99) C: 67% y B: 19% Solo 5 cepas documentadas con BLASA

Pruebas de Sensibilidad CIM en medio líquido (NCCLS) Caldo Mueller Hinton + Sangre lisada de caballo (2-5%) Incubación 24 hs/CO2/37º CIM en medio sólido (NCCLS) Agar Mueller Hinton + Sangre de carnero 5% Incubación 24 hs/CO2/37º E-test Agar Mueller Hinton + Sangre de carnero 5% Incubación 24 hs/CO2/37º Hughes y col. . La diferencia entre CIM en agar y E-test es ± 1 dil Blondeau y col. Fácil de usar, claro punto final, resultados rápidos y reproducibles (MH sin sangre) Marshal y col. 99.6% de reproducibilidad

N. meningitidis 1995- 2000 HNRG N= 58 Pen I = 61% Meningitis Meningococcemia Artritis Conjuntivitis Otitis 1995- 2000 HNRG N= 58 Pen I = 61% CIM50 0.12µg/ml CIM90 0.25µg/ml CTX CIM90: 0.008µg/ml RFA CIM90 : 0.016µg/ml

PATOLOGIAS ASOCIADAS A OTROS MIEMBROS Moraxella (Branhamella) catarrhalis Neisseria spp Infecciones Infecciones Meningitis Endocarditis Empiema Pericarditis Neumonía Otitis media Sinusitis Exacerbaciones agudas de Bronquitis crónica Bronconeumonía Endocarditis Meningitis

Bacteriemia por Moraxella catarrhalis. Estudio Multicéntrico Argentino con el sistema BacT/Alert de Hemocultivos Soloaga R (1)*; Almuzara M(2); Ascua,V (10); Casimir, L (3); Couto,E (20); Ebi,C (18); Erdoiz,J (20); Iglesias, M (5); Famiglietti, A(6); Gullo, H (7); Kovensky, J (8); Lanata,L (9); Lopardo, H(3); Lopez, M (17); Makler, R (11); Mange, L(12); Meo, A (17); Mortarini,M (20); Palombarani, S (2); Perrone, M (11); Piercamilli, A (14); Ponce,G (9); Ramirez Gronda, G (13); Rappazzini,J (14); Rigoni, A (14); Sarrouf, M R(16); Sarrouf, M N (16);Tanco, A (19); Tuduri, A (2); Vay C(6); Vazquez M(15); Vescina,C (14); Procopio A (15). (1) Maestría en Microbiología Clínica, Pontificia Universidad Católica Argentina. (2) Servicio de Microbiología del Hospital Eva Perón de San Martin, Buenos Aires. (3) Servicio de Microbiología del Hospital de Pediatría “Dr. Juan Garrahan”, Buenos Aires (4) Servicio de Bacteriología del Hospital de Enfermedades Infecciosas “F. J. Muñiz”, Buenos Aires (5) Servicio de Microbiología del Hospital “Dr. T. Alvarez”, Buenos Aires. (6) Servicio de Microbiología del Hospital de Clínicas “José de San Martín”; Buenos Aires. (7) Servicio de Microbiología del Hospital Vicente López y Planes, General Rodríguez, Buenos Aires. (8) Servicio de Microbiología del Hospital de Quemados, Buenos Aires. (9) Servicio de Microbiología de la Clínica San Camilo, Buenos Aires. (10) Servicio de Microbiología del Hospital Erill de Escobar, Buenos Aires (11) Servicio de Microbiología del Hospital “Jose M.Penna”, Buenos Aires. (12) Biomerieux Argentina. (13) Servicio de Microbiología del Hospital de Niños “Sor María Ludovica”, La Plata. (14) Servicio de Microbiología del Hospital Z.G.M de Martinez, Tigre, Buenos Aires (15) Servicio de Microbiología del Hospital de Niños “Ricardo Gutierrez”, Buenos Aires. (16) Servicio de Microbiología del Hospital Lagomaggiore, Mendoza. (17) Servicio de Microbiología del Hospital Ramos Mejía, Buenos Aires. (18) Servicio de Microbiología del Sanatorio Guemes, Buenos Aires. (19) Servicio de Microbiología del Hospital Español, Buenos Aires. (20) Servicio de Microbiología del Hospital de Infecciosas “F.J.Muñiz”, Buenos Aires. (21 ) Servicio de Microbiología del Hospital Interzonal de Agudos “San José”.Pergamino

MATERIALES Y METODOS Analisis retrospectivo entre el 1/1/2001 y el 30/10/2002 11 hospitales de la ciudad de Bs.As , 4 del Gran Bs.As.,1 de Pergamino, 1 de la ciudad de La Plata y 1 de la ciudad de Mendoza 145.874 hemocultivos 60.694 pacientes 30.246 (20,7%) muestras fueron positivas.

Bacteriemia asociada a Moraxella catarrhalis Paciente Sexo Edad (meses) Enfermedad de base Origen de la bacteriemia Tpo de positividad (horas) 1 M 24 Insuficiencia Respiratoria Neumonia 19.2 2 36 Síndrome Nefrótico Desconocido 9.8 3 Carditis 11.7 4 F No 47.5 5 17 HIV Otitis Media 10.9 6 22 Neuroblastoma Bronquitis 13.2 7 LLA 10.6 8 Chagas Cong. 10.3 9 108 Neuromuscular 12.5 10 15.7 11 48 9.9

TYM ACH 22º AN 35º GLU Mal Lac Sac Fru NO3 Polisa de sac DNAsa N.gonor-rhoeae POS Pos N.meningitidis V N.lactamica POs N.polysaccharea N.Cinerea N.subfla-va N.sicca N.mucosa N.flaves-cens N.elonga-ta B.ca-tarrhalis pos K.denitrificans Nd

Neisseria lactamica

Haemophilus

CARACTERISTICAS GENERALES Cocobacilos gram negativos. Pleomorficos Crecen mejor en atmósfera de 5-10% de CO2 La mayoría requiere factores X (hemina) y/o V (NAD, NADP)

Haemophilus influenzae MENINGITIS ETIOLOGIA Haemophilus influenzae

FACTORES DE VIRULENCIA Cápsula de polirobosa fosfato (a-f). Pili IGA proteasa Factores inhibitorios de actividad ciliar (LPS, glucopéptido) Endotoxina

INTERACCION CON EL HUESPED Colonización orofaríngea y conjuntival 50-80% de las personas principalmente con cepas no capsuladas 2-4% con serotipo b 1-2% con a,c,f Infecciones Invasivas Por contiguidad

Haemophilus influenzae Serotipos Cepas capsuladas (polisácaridos) b a c d e f Meningitis Celulitis Epiglotitis aguda Artritis Neumonía Otitis - Sinusitis Distinta patogenia: Meningitis secundarias a traumas, shunts, inmunosupresión Otitis media, sinusitis Neumonía (EPOC y FQ), exacerb. Agudas de bronquitis crónica Conjuntivitis Bacteriemia en neonatos Vulvovagintis en niñas Cepas no capsuladas

Haemophilus influenzae MENINGITIS DISTRIBUCION SEGÚN EDAD Haemophilus influenzae Argentina 2001 sobre 1308 casos con etiologías definidas

Muestras y medios de cultivo para aislamiento Líquidos estériles (LCR, Articular, punción de oído medio y de senos paranasales, punción de celulitis periorbitaria, líquido pleural) Tioglicolato o BHI + Agar chocolate (suplementado con isovitalex al 1%) + Agar sangre (no desarrolla H.influenzae) Sangre No utilizar lisis centrifugación Esputo de fibroquísticos Adicionar bacitracina al ACH Incubar ACH en anaerobiosis Hisopado conjuntival Siembra en forma de C (6) en agar chocolate con isovitalex 1% y agar sangre (H.influenzae no desarrolla)

OTRAS ESPECIES. INFECCIONES Haemophilus parainfluenzae, H. aprophilus (menos frecuentes H.haemolyticus) Endocarditis Absceso de cerebro Otitis media, sinusitis Neumonía, empiema Osteomielitis, artritis H.influenzae biovar. aegyptus Fiebre purpúrica brasilera

Cepas ß-lactamasa (+) (TEM-1, ROB-1, TEM-2) Resistentes Sensibles Amox/Clavulánico Ampi/Sulbactam Cefuroxima Cefaclor (*) C3ºG Ampicilina Amoxicilina (*) La actividad de cefaclor y cefproxil puede estar comprometida, ó las CIM aumentadas en 1 ó2 dil. Los aislamientos de ROB-1 son más R a estos ATBs Karlowsky et al.2000,JAC 45:871

Alteración de PBP La R a Ampicilina por éste mecanismo no supera el 5%. Bajo nivel de R a Ampi (CIM: 0.5-32µg/ml) Mayor problema para su detección Generalmente son cepas de origen respiratorio. La mayoría son ¨no b¨. Limitado impacto clínico

Alteración de PBP El método de difusión no permite una buena detección de estas cepas. Incorrectamente categorizadas como Sensibles. Utilizar algún método de dilución. Las cepas BLNAR deben considerarse Resistentes a: AMC, SAM, Cefaclor, Cefetamet, Cefprozil,Cefuroxima más allá de la aparente sensibilidad ¨in vitro¨. (Coment. (5) M2 Tabla 2E. NCCLS)

Hin BLNAR CEC CXM AP AMC HNRG

Haemophilus Test Medium HTM M2. Disk difusión Tabla 2E NCCLS M7. CIM Tabla 2E NCCLS Agar 15 µg/ml 5 mg/ml Mueller Hinton Hematina bovina Ext. Levadura NAD pH:7.2 Caldo (Ca+Mg) 15 µg/ml 5 mg/ml Incubación 35º / sin CO2 35º / CO2 5% Inóculo Suspención directa de colonia

Informe de Sensibilidad Sangre y LCR: Meningitis,Bacteriemia, Epiglotitis,Celulitis facial Infecciones respiratotias Otitis Vulvovaginitis ß-lactamasa ß-lactamasa Ampicilina Amox/clavulánico Azitro, TMS Cefuroxima, Ciprofloxacina Ampicilina Cloranfenicol C3ºG Meropenem

Haemophilus ducreyi Chancro blando (principalmente genitales externos y área perianal). Pápula con eritema, evoluciona a pústula que se ulcera. Dolorosa, no indurada, única o múltiple. Se acompaña de linfoadenopatía regional

Bassereau (1852), diferencia el chancroide de la sífilis Augusto Ducrey (1889), lo observó en exudados teñidos. Dra. P.Galarza

Haemophilus ducreyi Sífilis (T.pallidum). Diagnóstico diferencial Sífilis (T.pallidum). Linfogranuloma venéreo (C.trachomatis). Granuloma inguinal (Calymatobacterium granulomatis) Herpes simplex

EXAMEN DIRECTO Sensibilidad de 45 - 48 %. Dra P.Galarza

Haemophilus ducreyi Campo oscuro de la lesión negativo Diagnóstico probable Campo oscuro de la lesión negativo Serología para sífilis negativa a 7ías de aparición de la lesión Ulceras no típicas de HSV o cultivo negativo para el mismo Definitivo Aislamiento de H.ducreyi de la lesión

TOMA DE MUESTRA Limpiar bien la lesión con SF estéril. Humedecer un hisopo con SF y pasarlo por la base de la lesión. Inocular en medios selectivos Punción de ganglios regionales

MEDIOS DE CULTIVO GC-HgS:Agar base CG (Gibco) + 1% hemoglobina + 5% suero fetal bovino + 1% Isovitalex 1% (BBL) + vancomicina (3 ug/ml) MH_HB: agar de MH (BBL) + 5% sangre de caballo chocolatizada + 1% Isovitalex + vancomicina (3ug/ml) GC-FHB: agar bae GC (Gibco) + 5% extracto de Fildes (oxoid) + 5% sangre de caballo + vancomicina (3 ug/ml) GS-HgS + MH-HB (Ideal, 70-84% de sensibilidad)

AISLAMIENTO de H. ducreyi Dra P. Galarza

Transporte 4ºC (hasta 4 días) En tioglicolato con hemina, dioxido de selenio, glutamina o albumina

CARACTERISTICAS Gris amarillentas que se mueven intactas Alfa hemolíticas Requerimiento de factor X, fosfata alcalina positiva, reducción de nitratos y oxidasa positiva (reactivo tetrametilo). No requiere factor V, catalasa, ureasa, indol, ornitina negativos No produce ácido de glucosa, lactosa ni sacarosa Coloración de Gram característica

REQUERIMIENTO DEL FACTOR X Dra P.Galarza

SATELITISMO H. ducreyi H. influenzae Dra P. Galarza

TRATAMIENTO Régimen recomendado Ciprofloxacina, 500 mg oral, 2 veces diarias por 3 días Eritromicina base, 500 mg oral, 4 veces diarias por 7 días Azitromicina, 1 g oral, como dosis única Régimen alternativo Ceftriaxona, 250 mg IM, como dosis única

X V Hemolisis(sc) Glu Sac La Man Cata-lasa CO2 H.influenzae + - H.haemolyti-cus H,ducreyi H.parainfluenzae v H.parahaemolyticus H.segnis Debil H.aprhophi-lus H.paraprho-philus