Estado físico de la insulina Amorfo Cristalino

Estado físico de la insulina (II) Amorfo Cristalino Observac. Cristalina x Semilenta NPH Lenta 30%A;70%C Ultralenta PZI Brange, J

Estado fisicoquímico III El caso de la insulina NPH Insulina cocristalizada con cierta cantidad de la proteína básica Protamina -Se trata de una suspensión microcristalina Beavis et al., J.Pharm.Sci.,1999

Insulina: propiedades fisicoquímicas relevantes 6 Punto isoeléctrico De la insulina Z -10 6 12 pH Seis residuos capaces de adquirir carga + Diez residuos capaces de adquirir carga -

Insulina: propiedades fisicoquímicas relevantes Solubilidad Naturaleza del solvente pH Temperatura Concentración de metales divalentes Concentración de sales

Insulina: propiedades fisicoquímicas relevantes Zinc Binding 4 Zn H (Zn) (Ins) 4 Zn R H MC D M 2 Zn H 2 Zn R CO CC 5.4 pH

Preparados insulínicos Insulina Principio “retardante” Preservativos Fenol m-cresol metilparabeno Agentes isotónicos ClNa (glicerol) Buffers Acetato Fosfato

Estabilidad química de la insulina Agentes Bacteriostáticos Efecto estabilizante profundo Fenol>m-cresol>metilparabeno Efecto preventivo de la deaminación y de las reacciones cross-linking intermolecular Agentes isotónicos ClNa: estabilizante Glucosa, glicerol: incrementan el deterioro químico Protamina Formación de productos covalentes insulina- protamina Brange & Langkjaer, 1992

Estabilidad química de la insulina Efectos del pH A pH por debajo de 5 y por encima de 8 degradación rápida A pH ácido, deaminación en posición A21 y dimerización covalente Medio Alcalino: polimerización covalentes por reacciones disulfuro Brange & Langkjaer, 1992

Conservación de las insulinas Corriente 25°C 20% 20% 15°C Lenta 10% 4°C 1 2 años 1 año Contenido de desamidoinsulina. Insulina corriente porcina Desamidación según preparado Brange et al, 1985

Preparados insulínicos: Criterios de Clasificación Por su origen: Animales Bovinas Porcinas Humanas Semisintéticas, transpeptidadas o “humanizadas” Por bioingeniería E. coli S. cerevisciae

Insulinas: clasificación según la duración de acción Comienzo Pico Duración Insulinas ultrarrápidas Lispro <0.5 h 0.5-2.5 h 3.0-4.5 h B28Asp <0.5 h 0.5-2.5 h 3.0-4.5 h Insulinas rápidas Regular 0.2-0.5h 1.0-3.0 h 4.0-8.0 h Insulinas intermedias NPH 1.0-2.0 h 4.0-6.0 h 8.0-12.0 h Lenta (h) 1.0-2.0 h 4.0-8.0 h 8.0-14.0 h Lenta (Bv) 1.0-3.0 h 5.0-10.0 h 10.0-24.0 h Insulinas Prolongadas Ultralenta (h) 2.5 h 4.0-8.0 h 8.0-14.0 h Ultralente (Bv) 3 h 6.0-12.0 h 12.0-28.0 h

Pureza Cristalización facilitada por Zn+2 Recristalización Cromatografía Intercambio iónico En Gel Doble cromatografía (MC) Otros

Agonistas insulínicos Drogas que presentan: Afinidad por el receptor insulínico (1/KD) Actividad intrínseca Aspectos importantes: Farmacodinámicos Afinidad Potencia Eficacia Interacción con otros receptores Farmacocinéticos

Agonistas insulínicos Insulina Galénica convencional Innovaciones farmacéuticas Insulina inhalatoria HDV-I Insulinas orales Análogos de la insulina De acción ultrarrápida De acción prolongada Selectivos Modificadores de la actividad del receptor

Disociación de la Insulina tras la inyección subcutánea Tejido s.c. Mol/l 10-3 10-4 10-5 10-8 Difusión Membrana Capilar Adapted from Brange et al. 1990

Acción de la Insulina Receptor de Insulina Actividad de Insulina Tirosina Kinasa Proteínas transductoras de la señal Insulínica Efectos Metabólicos Efectos Mitogénicos

Insulinas orales Hexil-Insulina Monoconjugado 2 (HIM2) Insulina modificada por el agregado de oligómeros poliméricos que resisten la degradación gastrointestinal Dadona et al (2001): 15 pacientes tipo 1 Clement et al (2001): 18 pacientes tipo 1

Insulinas La insulina puede formar figuras poliméricas complejas Sin embargo, circula como monómero Ka es función del tiempo de “despolimerización”

Análogos de insulina Los efectos mitogénicos correlacionan mejor con la afinidad por el receptor a IGF-1 Lys-Pro y B28 Asp tienen similar afinidad por receptores a IGF-1 que Insulina Glargina: el caso de su afinidad por IGF-1 r Kurtzhals et al, Diabetes 49, 6, 2000

Análogos: requisitos Control Metabólico Hipoglucemia Calidad de Vida Perfil Variabilidad Hipoglucemia Calidad de Vida Seguridad EFECTOS MITOGENICOS INMUNOGENICIDAD ESTABILIDAD

Análogos de acción rápida Repulsión de cargas AspB28 AspB9,GluB27 GluB28,AspA21 Disminución de la hidrofobicidad interface GluB16,GluB27 Interferencia con los contactos hidrofóbicos LysB28,ProB29

Lys-Pro Análogo En preparados, se halla formando hexámeros (estabilizados por zinc y derivados fenólicos a 4°C) Los hexámeros se disocian en monómeros casi instantáneamente tras la inyeción subcutánea Bolli et al, Diabetologia, 1999, 42: 1151-1167 Radziuk et al, Diabetes, 1997, 46: 548-556

Insulin aspartica Pro Asp Phe Gly Phe Arg Tyr Glu Thr Gly Asp Cys Lys B28 B30 Thr A21 Asn Cys Val Tyr Leu A1 Gly Asn Tyr Ile Glu Leu Val Leu Ala Glu Gln Glu Gln Tyr Val Cys Leu Cys Thr Ser Ser Ile Cys Leu His Ser Gly Cys Leu B1 Phe Val Asn Gln His

Estructuras Cristalinas Insulina aspartica Insulina humana nativa B30 Thr B29 Lys B21’ Glu B22’ Arg B23’ Gly B27 Thr 3.7Å B28 Pro/Asp Adapted from Brange, Vølund. 1999

Análogos de acción rápida Metaanálisis de Brunelle Datos de 8 estudios 2327 pacientes con Análogo Ultrarrápido 2339 pacientes con insulina regular Técnica: Cochran-Mantel-Haenszel Resultados: al menos 1 episodio en 3.1% de los pacientes con análogo rápido y en 4.4% de los tratados con insulina regular (p=0.024) Anderson et al. Arch.Intern.Med.1997,157: 1249-55

NovoRapid en Niños tipo 1 Insulina aspartica Soluble humana (0.15 U/kg) 10 8 Cambios en la glucosa sérica (mmol/l) 6 4 2 -30 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 Desayuno Tiempo (minutos)

Perfil Glucémico con insulina corriente en Tipo 1 Niveles normales de insulin libre (Mean) s.c. soluble humana + NPH Comidas 70 60 50 Insulina (mU/l) 40 30 20 10 0600 0900 1200 1500 1800 2100 2400 0300 Hora del Día Desayuno Almuerzo Cena NPH Adapted from Polonsky et al. 1988

Análogos de acción rápida Hipoglucemias leves 5 / 22 Hipoglucemias severas 2 / 12 Hipoglucemia nocturna 6 / 24 Heinemann, L. Journal of Diabetes and Its Complications, 1999,13:105

Variabilidad

Análogos de acción prolongada Análogos con punto isoeléctrico neutral Análogos “acilados” Otros análogos

Análogos de acción prolongada por cambios en el punto isoeléctrico El caso de la A21 Gly, B27 Arg, B30 Thr-NH2 Baja variación intraindividual Alta variación interindividual Baja biodisponibilidad La diarginil insulina (B31, B32 Arg insulina) La insulina glargina (21A-Gly-30Ba-L-Arg-30Bb-L-Arg) Otras aproximaciones: B13 Gln, B27 Arg, B30 Thr-NH2

Glargina Punto isoeléctrico pH 5.4 6.7 + 0.2 La molécula es soluble en medio ligeramente ácido Menor solubilidad al pH fisiológico del tejido s.c.

Análogos “acilados” Lys-B29 tetradecanoyl, des B30 (NN 304) N()-Palmitoyl Lys B 29 (WW29-S32)

Insulin Detemir (NN304) C14 Cadena de ácido graso (Acido Mirístico) Phe Gly Phe Arg Tyr Glu Thr Gly Pro Lys Cys Thr Lys B29 A21 Asn Cys Val Tyr Leu A1 Gly Asn Tyr Ile Glu Leu Val Leu Ala Glu Gln Glu Gln Tyr Insulin detemir is an engineered analogue of insulin, produced by recombinant DNA techniques. The amino acid threonine at the B30 position has been removed, and a 14-carbon fatty acid has been attached to the amino acid lysine at position B29. These modifications to the insulin molecule radically change its properties of absorption and distribution, leading to a protracted action profile. Insulin detemir is also soluble at neutral pH. Val Cys Leu Cys Ser Thr Ser Ile Cys Leu His Ser Gly Cys B1 Phe Val Leu Asn Gln His

Mecanismo de enlentecimiento en la insulina detemir ASH ASH ASH ASH Absorción ASH Interacción con el receptor ASH ASH ASH The mechanism of protraction of insulin detemir is believed to occur by a combination of hexamer-aggregation and albumin binding. Insulin detemir is injected as hexamers, and these hexamers aggregate by contact between the 14-carbon fatty acid side chains. Importantly, insulin detemir binds to interstitial albumin at the injection site. It is released slowly from this albumin as monomers, which are absorbed into the circulation. Here, the insulin detemir monomer again binds to albumin, protracting its distribution to the target tissue. Insulin detemir is more than 98% albumin-bound in plasma. Finally, albumin binding in the target tissue may further protract the action of insulin detemir, because only the free (unbound) insulin detemir is available to interact with the insulin receptor. As well as being largely albumin-bound, the subcutaneous depot of insulin detemir differs to that of other long-acting insulins, such as NPH and glargine, in that it is soluble rather than crystalline. This means it has a greater surface area and is therefore expected to to be absorbed with less variability. Capilar Distribución ASH IR ASH ASH ASH: albúmina sérica humana

Unión al receptor de Insulina 1000 Insulina Humana 800 Insulina detemir 600 Radiactividad unida (cpm) 400 In vitro binding experiments have shown insulin detemir to have a lower affinity for the insulin receptor than human insulin. This would imply that higher molar doses would be needed to achieve the same insulin receptor-mediated physiological effects. The plot shows the radio-active trace of radio-labelled insulin recovered from microtitre plate-fixed soluble human insulin receptors, when different levels of human insulin or detemir were added as competitor ligands. Human insulin was seen to compete (and hence reduce the recovery of radio-labelled ligand from the microtitre plates) at lower concentrations than insulin detemir. 200 Kurtzhals et al. Diabetes 2000,49:999-1005 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 Log de la Concentración de Insulina (M)

NN304: Potencia metabólica pmol/ml 400 800 1200 1600 2000 .01 0.1 1 10 100 CPM Potencia Metabólica (%) Lipogénesis, adipocitos de ratón Con respecto a la insulina humana rHI Insulina Humana 100 Detemir Insulina detemir ~ 27 Kurtzhals et al. Diabetes 2000,49:999-1005

Afinidad Insulina-Receptor La Potencia metabólica se correlaciona con la afinidad Insulina - Receptor Afinidad Insulina-Receptor Potencia metabólica Insulina Humana = 100 = 100 B10Asp 205 ± 20 207 ± 14 Insulina aspártica 92 ± 6 101 ± 2 Insulina lispro 84 ± 6 82 ± 3 Insulina glargina 86 ± 3 60 ± 3 Insulina detemir ca 18–46 ca 27 Kurtzhals P et al. Diabetes 2000;49:999

Unión con el Receptor de IGF-1 Saos / B10 Células 18000 14000 10000 Radiactividad (cpm) 6000 IGF-1 Insulina Humana 100% X10 975% 2000 NN304 ca. 11% -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 Ligando (M) Kurtzhals et al. Diabetes 2000;49:999-1005

Afinidad Receptor - IGF-I y Potencia Mitogénica (Saos/B10 células) Afinidad IGF-1 - Receptor Insulina Humana = 100 = 100 B10Asp 587 ± 50 975 ± 173 Insulina aspártica 81 ± 9 58 ± 22 Insulina lispro 156 ± 16 66 ± 10 Insulina glargine 641 ± 51 783 ± 13 Insulina detemir 16 ± 1 ~ 11 Kurtzhals P et al. Diabetes 2000;49:999

Selectividad Análogos “hepatoselectivos” El caso de la proinsulina Análogos diméricos N()B1,N()B´1-suberoyl- dímero N()B29, N()B´29-suberoyl- dímero Tiroxil análogos N1-tiroxil-insulina N1-tiroxil-aminohexanoil-insulina Vajo & Duckworth, Pharmacological Reviews, 52,1,2000

Análogos: puntos a destacar desde la óptica del ensayo clínico Menor frecuencia de hipoglucemias nocturnas y severas Menor incremento de peso corporal Distinta potencia Similar eficacia Rediseño del esquema de tratamiento

Insulina inhalatoria AERx Aerosol particulado fino “Mass Median Aerodynamic Diameter”: 2-3 micrones Perfil de duración del efecto similar al de los análogos Ultrarrápidos Inhaladores: liberación de la insulina cuando la velocidad Inspiratoria y el volumen inhalado son apropiados

Insulina inhalatoria AERx s.c. Tmáx 7-20 min 50-60 min TGmin 60-70 min 100-120 min Covariados que modifican respuesta: Profundidad de la inspiración (40% vs 80% de capacidad vital).

Insulina inhalatoria Technosphere/Insulin Biodisponibilidad a 3 horas: 15-25% Tiempo al efecto máximo: 39 + 36 min (vs 163 + 25 min) Exubera (polvo seco) Tos: 21% vs 3% - No discontinuación Tests de función pulmonar: sin modificaciones

Insulina inhalatoria Biodisponibilidad Bioseguridad Estudios en asmáticos Estudios en fumadores

Insulina subcutánea Revierte el gradiente usual porto / periférico de la insulina Davis et al., 2001 Ello determina una cierta hipoinsulinemia hepática relativa Sólo un 1% de la insulina inyectada en forma s.c. alcanza a los hepatocitos Canfield et al, 1972

Insulinas hepatoselectivas Control hepático de la producción de glucosa por insulina Mecanismos periféricos - reducción del flujo de ácidos grasos y de sustratos gluconeogenéticos Lewis et al, 1996 Mecanismos hepáticos directos - Incremento de la captación hepática de glucosa - Inhibición directa de la gluconeogénesis Davis et al, 2001

Captación de glucosa por el hígado en función de la insulinemia portal Capt Glucosa (umol/Kg/min) Grupo Myers et al, 1991

Insulinas hepatoselectivas Análogas Liposomales + “specific hepatobiliary target molecule” (SHTM) insulina soluble liposomal + ácido 2,6 diisopropil-fenil-carbamoil metil iminodiacético = insulina HDV (“Hepatic Directed Vesicle Insulin”)

HDV-I Captación Hepática

Beta-hidroxibutirato y HDV-I Concentración de b-hidroxibutirato (umol/l) * *p<0.05 Davis et al, 2001

Selectividad Análogos “hepatoselectivos” El caso de la proinsulina Análogos diméricos N()B1,N()B´1-suberoyl- dímero N()B29, N()B´29-suberoyl- dímero Tiroxil análogos N1-tiroxil-insulina N1-tiroxil-aminohexanoil-insulina Vajo & Duckworth, Pharmacological Reviews, 52,1,2000