Fragmentos circulantes de propéptido natriurético tipo B N-terminal en el plasma de pacientes con insuficiencia cardiaca J. Y. Y. Foo, Y. Wan, B. L. Schulz, K. Kostner, J. Atherton, J. Cooper-White, G. Dimeski, y C. Punyadeera Octubre de © Copyright 2013 by the American Association for Clinical Chemistry

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Introducción: problema clínico actual  Insuficiencia cardiaca (IC):  un problema sanitario mundial  asociado con resultados clínicos deficientes  carga económica considerable  El péptido natriurético tipo B (BNP) en plasma o el fragmento N- terminal del propéptido natriurético cerebral (NTproBNP) mejoran la exactitud del diagnóstico en pacientes con sospecha de IC  Sin embargo, su utilidad en la detección en poblaciones asintomáticas y en la supervisión está limitada por la variación entre pacientes y en cada paciente, así como la presencia de varias formas del péptido NTproBNP en la sangre

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Finalidad del estudio:  Identificar y cuantificar la principal forma del NT- proBNP circulante en plasma obtenido de pacientes con IC  Informar el desarrollo de los análisis de diagnóstico de última generación

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Preguntas de la investigación  ¿Cuáles son los fragmentos circulantes comunes de NT- proBNP en sangre de los pacientes con IC?  ¿Está fragmentado el NT-proBNP en la circulación (es decir, en la sangre)?  ¿Qué fragmento debe ser el objetivo de los análisis de NT- proBNP para nuevos fines de diagnóstico?

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Materiales y métodos  Participantes y obtención de muestras  Todos los participantes eran mayores de 18 años y proporcionaron consentimiento por escrito  Se reclutaron 20 pacientes con IC asintomática [New York Heart Association (Asociación del Corazón de Nueva York, NYHA) clase funcional III - IV]  Las muestras de sangre se obtuvieron en tubos de AEDT para minimizar la degradación in vitro de NT-proBNP; se centrifugaron; se separó el plasma y las partes se almacenaron a C hasta su análisis.  Inmunoprecipitación  Utilizada para identificar los principales productos proteolíticos de NTproBNP en la circulación  El plasma de los pacientes con IC (n= 4) se usó para las reacciones de inmunoprecipitación (IP)

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Materiales y métodos (continuación)  Inmunoprecipitación y espectrometría de masas  El anticuerpo monoclonal NT-proBNP (aminoácidos selectivos 13–20 ) se conectó químicamente a Dynabeads® M-270 Epoxy (Invitrogen) mediante química EDS-NHS [1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)-carbodiimida y N-hidroxisuccinimida] conforme a las instrucciones del fabricante.  El NT-proBNP de plasma enriquecido se digirió con tripsina en 50 mmol/l Tris-HCl pH 7.5 con 10 mmol/l ditiotreitol a 37 °C durante 16 h; se quitó la sal con C18 ZipTips (Millipore) y se analizó mediante cromatografía de líquidos (LC)-ionización por electronebulización–espectrometría de masas en tándem (MS/MS) con un sistema Prominence nanoLC (Shimadzu) en un espectrómetro de masas TripleTof 5600 con una interfaz Nanospray III (AB SCIEX)

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Materiales y métodos (continuación)  Inmunoprecipitación y espectrometría de masas  Las proteínas se identificaron mediante Protein Pilot (AB SCIEX) y la búsqueda se realizó en la base de datos LudwigNR 8 (descargada en ogies/proteomics/wehi_systems_biology_mascot_server conforme a la actualización del 27 de enero de 2012; 16,818,973 secuencias; 5,891,363,821 residuos)  Se incluyeron los péptidos identificados con un 99 % de confianza y con una tasa de detección falsa local del 1% para su posterior análisis, y se inspeccionaron manualmente los espectros de fragmentación de espectrometría de masas en tándem  Los cromatogramas de iones extraídos se obtuvieron mediante PeakView 1.1

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Figura 1. Los 6 inmunoanálisis utilizan anticuerpos monoclonales de grado diagnóstico para detectar NT-proBNP1-20, NT-proBNP13-45, NT-proBNP1-45, NT-proBNP28-76, NT- proBNP13-76 y NT-proBNP1-76. Los sitios de proteólisis en el extremo N y C terminal detectados por nuestro estudio se muestran con líneas verticales rojas. * Par de anticuerpos con la mayor concentración de NT-proBNP. Puntos de unión del anticuerpo en los 6 fragmentos de NT- proBNP glucosilado O-glucosilación NH2COOH 761 *

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Tabla 1. Tabla 1. Péptidos NT-proBNP obtenidos por proteólisis con tripsina total y parcial identificados después de la inmunoprecipitación (IP) del plasma.

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Figura 2. Proporción relativa de péptidos obtenidos por proteólisis con tripsina total y parcial por el extremo N y C terminal de NT-proBNP purificados por IP de pacientes individuales. (A) Péptidos del extremo N terminal: azul, H1-R21; rojo, L3- R21; verde, G4-R21; púrpura, G7-R21. (B) Péptidos del extremo C terminal: naranja, M67-R76; rosado, M67-P75. Proporción relativa de péptidos obtenidos por proteólisis con tripsina total y parcial por el extremo N y C terminal de NT- proBNP Paciente Proporción

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Figura 3. Los porcentiles 25, 50 (mediana), 75 se indican en los gráficos de caja y bigotes. * Notablemente diferente de la concentración de NT-proBNP 13–76 al nivel P < Fragmentos circulantes de NT-proBNP en la sangre de pacientes con IC (n=20). Concentración Fragmentos de NT-proBNP

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Figura 4. Se realizó la correlación de Spearman entre los niveles de plasma NT- proBNP13-76 y NT-proBNP1-20 (Spearman r=0.890, p<0.0001) y NT-proBNP13-45 (Spearman r=0.859, p<0.0001). Correlación de NT-proBNP con NT-proBNP 1-20 y NT- proBNP en pacientes con IC. C

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Principales conclusiones  Los anticuerpos dirigidos al extremo N muestran bajas concentraciones aparentes (1-76 frente a 13-76; 1-45 frente a 13-45).  Los anticuerpos dirigidos al extremo C muestran bajas concentraciones aparentes (1-76 frente a 1-20)  Los anticuerpos dirigidos a la región glucosilada muestran bajas concentraciones aparentes (1-45 frente a 1-76) Conclusión El NT-proBNP se encuentra proteolíticamente truncado en los extremos N y C, y se encuentra glucosilado en su región central. Para lograr un inmunoanálisis óptimo, los anticuerpos no deberían dirigirse a esas regiones

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