LA BIODIVERSIDAD COMO FUENTE DE NUEVOS AGENTES ANTi-cÁncer: EL CASO DE MEXICO y CENTROAMERICA Armando Cáceres, Patricia Saravia y Sully M. Cruz Facultad de CCQQ y Farmacia, Universidad de San Carlos y Laboratorios de Productos Naturales Farmaya S.A., Guatemala. E-mail: acaceres@farmaya.net VIII Simposio Iberoamericano de Plantas Medicinales II Simposio Iberoamericano de Investigación en Cáncer Mesa Redonda: La biodiversidad como fuente de nuevos agentes anticáncer: Aspectos actuales y perspectivas Ilheus, 29 de octubre de 2014.

FITOTERAPIA: Cadena multidisciplinaria con Buenas Prácticas IDENTIDAD Etnobotánica PRODUCCION Agrotecnología VALIDACION Biomedicina FITOTERAPIA: Cadena multidisciplinaria con Buenas Prácticas Articulación Comercialización UTILIZACION Fitoterapia TRANSFORMACION Fifofarmacia FORMULACION I&D Regulación Registro

Investigación etnobotánica Ciencia que estudia el uso popular de los seres vivos silvestres o naturalizados de una región, etnia o época determinada. Población  Etnobotánica  Etnofarmacología Metodologia. Encuestas (general, regional, etnomédica, botánica) Caminatas etnobotánicas con conocedores Encuestas regionales interinstitucionales realizadas entre 1976-2004 dieron como resultado: 10 etnias encuestadas: Quiché, cakchiquel, mam, achi, tzutuhil, kekchi, garífuna, kanjobal, uspanteka y pocomchi. Informantes ~ 1500 (hombres y mujeres) Detección: 116 familias, 424 géneros, 637 especies

Criterios para la selección de especímenes Universo estimado: 370,000-500,000 especies Causas tradicionales de salud-enfermedad Selección basada en tradición, venenosas o composición (familias, quimiotipos) Tamizaje de una bioactividad específica Combinación de criterios Etnobotánica  BPC según OMS Permiso de colecta (Lista roja, otros) Planificación técnica (Lugar de colecta, información esencial, hábitat, hábito, etc.) Selección de plantas para colecta Colecta (sobrevivencia de la especie, época de colecta, condiciones adecuadas) Personal (local, apoyo, profesional) WHO (2005) Good collection practices for medicinal plants. Geneva.

Formas de uso de las plantas tradicionales en la medicina moderna Uso como agente terapéutico directo (Ej. Alcaloide D-tubocurarina de Chondrodendron tomentosum, relajante muscular que no se ha podido sintetizar). Uso como punto de partida para la elaboración semi- sintética (Ej. Extractos de los que se producen sapogeninas para producción de esteroides). Substancia de la flora que puede usarse como modelo para la síntesis de nuevas moléculas (Ej. La cocaina de Erythroxylum coca ha servido de modelo para la síntesis de anestésicos como procaína). Plantas usadas como marcadores taxonómicos (Ej. Las Liliaceas son rica en alcaloides, pero pobres estudios en la familia Orchidaceae). Gurib-Fakim A (2006) Molecular Aspects of Medicine 27:1-93.

Opiniones de expertos Como consecuencia del tiempo que toma la colecta de plantas con historia etnomédica, pareciera que la colección al azar seguida de ensayos HTS in vitro podría ser el futuro en la industria farmacéutica. Sin embargo, los estudios etnobotánicos por los centros de investigación y universidades seguirán siendo los mayores contribuyentes al proceso de descubrimiento de drogas. Se prevé que la búsqueda de compuestos activos de la biodiversidad para el desarrollo de moléculas sintéticas, garantizando una protección por patentes, será un proceso en evolución científica constante. Nogueira RC et al. Expert Opin. Ther. Patents 2010; 20:145-57, basado en Balunas & Kinghorn Life Science 2005; 78:431-41 y Schuster BG J. Alter. Complement . Med. 2001; 7:61-72

Descubrimiento de drogas en la academia El alto costo, intensivo en mano de obra y aspectos que no llevan a nuevas hipótesis del descubrimiento de drogas, hacen que la academia tenga los elementos y nicho natural para participar activamente en estos procesos de descubrimiento. Es conveniente que la investigación académica se enfoque en blancos o enfermedades de limitado valor comercial, como las del III Mundo o aquellas que raras y requieren de modelos específicos. Un ejemplo interesante es el descubrimiento de pequeñas moléculas inhibidoras y activadoras del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis cística. Verkman AS. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2003; 286:C465-C474

Nueva generación de fitoterápicos: Investigación sinergística Se reconoce la importancia de la investigación sinérgica en la investigación de nuevos fitoterápicos cuyos mecanismos de acción farmacológica podrían ser: Efectos sinergísticos multi-blanco Efectos basados en aumento de la biodisponibilidad Interacción con mecanismos de resistencia Eliminación o neutralización de efectos adversos Evidencia clínica de efectos sinérgicos Valeriana officinalis + Humulus lupulus Urtica dioica + Pygeum africanum Panax ginseng + Ginkgo biloba Wagner & Ulrich-Merzanich (2009) Phytomedicine 16:97-110

Otras opiniones líderes Con los recientes avances con HTS en la mayoría de las industrias farmacéuticas y el aumento de las restricciones gubernamentales en la aprobación de drogas, es posible que el número de nuevos productos derivados de drogas pueda llegar a cero. Sin embargo esto se espera que sea temporal, ya que el potencial de los nuevos descubrimientos de productos naturales en el largo plazo es enorme. A pesar que los nuevos esquemas de la industria farmacéutica no favorecen los productos naturales, estos son tan vastos y casi ilimitados que siempre serán una fuente de descubrimientos que lleven a nuevas drogas para beneficio de la humanidad. Li JWH & Vederas JC (2009) Science 325:161-65

Comparación entre Etnofarmacología y Bioprospección masiva Etnofarmacología clásica Bioprospección masiva Información basada en la tradición y uso popular Obtención de resultados por bioprospección masiva al azar Mayor posibilidad de éxito y posiblemente mayor seguridad Requiere de un gran número de muestras y riesgo desconocido Librería natural ilimitada Librerías limitadas a 100 miles Metodologías mas sencillas intensivas en mano de obra Metodologías complicadas dependientes de alta tecnología Mas susceptible de desarrollo en los ambientes académicos Desarrollo por el sector comercial o por alianza múltiple Menores posibilidades de protección con patentes Mayores posibilidades de protección con patentes

Citotoxicidad de extractos crudos de plantas medicinales mexicanas Gutierrez-Lugo MT et al. (1996) Phytomedicine 2:341-347. Objetivo: Tamizar la actividad citotóxica de plantas usadas en la medicina tradicional mexicana como agentes anti-infecciosos. Metodología: 31 extractos metanólicos o clorofórmicos de 28 especies se evaluaron por su actividad antimicrobiana y contra líneas celulares de adenocarcinoma de colon (HT-29), carcinoma de mama (MCF-7) y carcinoma de pulmón (A-549). Resultados: 5 especies demostraron actividad antimicrobiana, pero solamente Helianthella quinquenervis tuvo actividad antimicrobiana y citotóxica contra MCF-7 (ED50 13.1 mg/ml)

Citotoxicidad de planta s usadas como antitumorales en México Popoca J et al. (1998) J. Ethnopharmacol. 59:173-177. Objetivo: Tamizar la actividad citotóxica de plantas de la medicina tradicional mexicana como antitumorales Metodología: Extractos crudos (éter de petróleo, acetato de etilo y metanol) de 9 especies evaluadas en triplicado (1-100 mg/ml) por su actividad citotóxica contra líneas de carcinoma nasofaríngeo (KB), carcinoma de colon (HCT-15) y carcinoma escamoso de cérvix (UISO-SQC) Resultados: De 27 extractos de 9 plantas, 3 plantas demostraron importante actividad citotóxica, mostrando cierto grado de selectividad contra el cultivo celular ensayado.

Citotoxicidad de plantas mexicanas Nombre (Familia) Extracto HCT BK UISO Acacia pennatula EP 41.7 20.9 16.6 (Fabaceae) EtOAc >100 17.4 25.1 MeOH 60.3 10.0 Colubrina macrocarpa 6.6 (Rhamnaceae) 2.1 5.8x10-6 0.6 9.1 6.3x10-4 7.9x10-2 Hemiangium excelsum 0.76 4.4x10-3 5.8x10-3 (Hippocrateaceae) 2.4 4.0 3.1 1.9 10.9 36.3 * ED50 mg/ml Popoca J et al. (1998) J. Ethnopharmacol. 59:173-177

Piper jacquemontianum Blepharocalyx salicifolius Actividad citotóxica en plantas LA Calderón AI et al. (2006) Pharm. Biol. 44:130-140 Muestra: 310 especies con información etnomédica colectadas en 7 países de Latinoamérica. Metodología: Determinación de actividad citotóxica contra líneas celulares de cáncer humano [mama (MCF-7), pulmón (H-460) y SNC (SF-268)] por bioensayo sulforodamina B (SRB). Resultados: 23 (7.4%) especies demostraron actividad citotóxica (GI50 <10μg/ml) Thevetia ahouai Physalis viscosa Piper jacquemontianum Piper barbatum Senna occidentalis Tovomita longifolia Lippia cardostegia Blepharocalyx salicifolius

Citotoxicidad de plantas de la medicina tradicional maya Mena-Rejon et al. (2009) J. Ethnopharmacol. 121:462-465. Objetivo: Investigar la actividad citotóxica de plantas de la medicina tradicional maya. Metodología: Extractos metanólicos de 9 especies se evaluaron contra cuatro líneas celulares de cáncer [laringe (Hep-2), nasofaringe (KB), cérvix (HeLa) y cérvix escamoso (SiHa)] y células normales de riñón canino (MDCK), por medio de un bioensayo espectrofotométrico a 540 nm después de agregar MTT.

Citotoxicidad de plantas de la medicina maya Mena-Rejon et al. (2009) J. Ethnopharmacol. 121:462-465 Resultados: Todas las especies mostraron algún nivel de citotoxicidad, siendo la mas activa la corteza de raíz de Hamelia patens contra células HeLa (CC50 13 mg/ml) con un índice de selectividad alto (13.3). Los extractos de Gossypium schottii y Dioon spinulosum tuvieron actividad contra células HeLa y Hep-2 con buen índice de selectividad

Actividad citotóxica (GI50: mg/mL ) de extractos de 24 especies de Guatemala Cooperación entre Facultad de CCQQ y Farmacia, USAC (Guatemala) y U. de Panamá en el marco del proyecto AICD/AE-106 de la OEA y de la red RIBIOFAR del CYTED Smilax domingensis Thevetia ahouai Especie Organo/Sol SF-268* MCF-7 H-460 Hypericum uliginosum Hoja EtOH 6.4 9.8 11.0 P. jacquemontianum 4.6 3.0 4.9 Piper variabile Hoja DCM 4.7 6.3 7.1 Thevetia ahouai 0.52 0.47 0.29 Smilax domingensis 27 16 12 Calderon AI et al. (2006) Pharm. Biol. 44:130-140. Cáceres A et al. (2012) Braz. J. Pharmacog. 22:239-248.

Citotoxicidad de plantas de la medicina tradicional maya para tratar cáncer Caamal-Fuentes et al. (2011) J. Ethnopharmacol. 135:719-724 . Objetivo: Tamizar la actividad citotóxica de extractos de plantas usadas en la medicina tradicional mexicana para tratar síntomas parecidos a cáncer. Metodología: Se evaluaron extractos metanólicos contra siete líneas celulares de cáncer [pulmón (A549), cérvix (HeLa y SiHa), laringe (Hep-2), nasofaringe (KB), mama (MCF-7) y próstata (PC- 3)], y células normales embrionarias de riñón (HEK-293) por un bioensayo micrométrico y lectura espectrofotométrica a 540 nm usando MTT.

Caamal-Fuentes et al. (2011) J. Ethnopharmacol. 135:719-724. Resultados: Se detectaron 51 plantas usadas para tratamiento de sintomatología similar a cáncer de las cuales se escogieron 21 para evaluación citotóxica. Las cortezas de las raíces de Aeschynomene fascicularis y Bonellia macrocarpa demostraron actividad contra células HeLa y KB y un índice de selectividad similar alrededor de 1. Caamal-Fuentes et al. (2011) J. Ethnopharmacol. 135:719-724.

Plantas mexicanas usadas contra cáncer Alonso-Castro et al. (2011) J Plantas mexicanas usadas contra cáncer Alonso-Castro et al. (2011) J. Ethnopharmacol. 133:945-972. Objetivo: Revisar la flora medicinal mexicana usada por su actividad anticáncer. Metodología: Revisión de la bibliografía nacional e internacional de los últimos 50 años y clasificación de resultados en cinco categorías Resultados: Se detectaron 300 especies vegetales pertenecientes a 90 familias; solo 181 han sido analizadas experimentalmente, de ellas 88 tienen alguna actividad citotóxica in vitro y 14 han sido investigadas in vivo, demostrándose actividad anti-neoplásica solamente en una. Se han aislado 187 compuestos de 19 familias químicas

Citotoxicidad contra líneas celulares de cáncer de compuestos aislados de plantas mexicanas Nombre científico Parte/Ext Tipo molecular Annona muricata H/EtOH Annopentocina A, B y C Annona purpurea S/MeOH Purpurediolina Montanoa leucantha H/EtOAc Leucantanólido Viguiera hypargyrea A/MeOH 8b-(epoxiangeloiloxi) 14 hidroxitithifolina Viguiera quinqueradiata H/Cloro 15-hidroxi acetil-leptocarpina Gelsemium sempervirens 12b-hidroxi-5a-preg-16-eno-3,20 diona Salvia leucantha A/Aceto Salvileucalina B Persea americana F/EtOH 1,2,4-trihidroxinonadecano Zea mays F/MeOH Acido 13-hidroxi-10-oxo-trans-11-octadecanóico

Efectos antitumorales de compuestos aislados de plantas mexicanas Nombre científico Parte/Ext Molécula/Actividad y modelo Annona diversifolia (Annonaceae) Semilla/ Hexano Laherradurina y Cherimolina 2/ HeLa y SW-40 en ratón atímico Hymenoxys odorata (Asteraceae) Hierba/ Acetona Himenobina/Carcinoma mamario en ratón CH3 Hyptis emory (Lamiaceae) Hierba/ Cloroformo Acido betulínico/Carcinoma de Walker 5WA16, rata Sprague Capraria biflora (Scrophulariaceae) Raíz/ Eter pet. Biflorina/Sarcoma 180 y de Ehrlich en ratón suizo

Actividad citotóxica (GI50: mg/mL ) de 46 extractos de 18 especies (Litsea, Piper, Rizhopora) de Guatemala Cooperación entre CCQQ y Farmacia, USAC (Guatemala) y CPQBA-UNICAMP (Brasil) en el marco de RIBECANCER/CYTED. Fraccionamiento y aislamiento químico en colaboración con IQ-USP P. sempervirens Especie de Piper Organo/Sol U251* MCF-7 H460 P. patulum Raiz DCM 29.0 3.8 42.1 Hoja DCM 26.5 3.5 44.2 P. retalhuleuense 26.1 19.9 28.3 P. jacquemontianum 19.6 6.5 7.2 P. variabile 22.4 25.9 26.6 P. sempervirens 0.25 1.8 3.0 Hoja MeOH 4.7 14.9 9.0 Doxorubicina Control 0.029 0.025

Actividad citotóxica y citostática de plantas medicinales de Guatemala Cates RG et al. (2013) J. Med. Plants. Res. 7:2616-2627. Objetivo: Evaluar la actividad citotóxica y citostática de plantas medicinales guatemaltecas contra líneas celulares tumorales. Metodología: Se prepararon extractos de material fresco licuado por maceración con etanol 95%, se concentraron en rotavapor y liofilizaron. La actividad citotóxica y citostática se evaluó contra seis líneas celulares de cáncer [mama humano (MDA-MB-231 y MCF7), próstata (PC-3), colon (HT-29), mama murino (4T1) y leucemia monocítica (RAW-267)]. Se empleo el bioensayo con SRB por 24 h seguida de evaluación colorimétrica a 515 nm.

Citotoxicidad en plantas del oriente de Guatemala Cates RG et al Citotoxicidad en plantas del oriente de Guatemala Cates RG et al. (2013) J. Med. Plants Res. 7(35):2616-2627 Resultados: 7 (9.6%) especies demostraron actividad citotóxica (CI50 <200 μg/ml), en la mayoría de casos con CC50 >800 por el ensayo de rojo neutro en células Vero. Mama Cervix Piel Lengua Baccharis latifolia >200 A (119±60) A (75±4) Bursera simaruba A (113±38) A (148±14) Byrsonima crassifolia M (52±9) M (72±3) Guazuma ulmifolia A (67±3) A (68±6) Quercus acatenangensis A (86±3) M (77±4) Solanum americanum M (195±4) A (139±9) M (171±3) Solanum esculentum M (33±6) M (47±18) M (36±2)

Actividad citotóxica de 17 extractos de 10 especies (Cornutia, Piper, otras) de Guatemala Cooperación entre USAC (Guatemala) y UCR (Costa Rica) en el marco de RIBECANCER/ CYTED, usando el bioensayo con sulforodamina B e índice de selectividad (*>5) por citotoxicidad sobre células Vero. Piper psilorhachis C. pyramidata Especie Organo/ Disolvente Colon (SW620) Mama (MCF-7) Pulmón (H460) Piper psilorachis Hoja DCM 45.7±2.5* 11.7±3.9* 167±9 P. retalhuleuense 44.5±3.5 14.2±8.0* 31.1±9.8 P. umbellatum Hoja MeOH 118±43 220±80 67.0±7.4 Cornutia pyramidata 47.9±4.9 59.3±0.5 33.2±9 122.2±43.0 44.8±25.3 65.7±13.1 Acaeda elongata Hoja EtOH 79.4±10.5 332±25 65.6±3.1 Doxorubicina Control 0.05 0.01 0.02

Conclusiones Existen múltiples grupos en Latinoamérica que están investigando la actividad antineoplásica. Esta búsqueda requiere condiciones químicas y farmacológicas complejas y especializadas. De unas 500 especies nativas evaluadas, se han detectado unas 50 especies con actividad potencial por su actividad anti-cáncer de las que se han aislado unas 30 moléculas interesantes que debe seguirse desarrollando. Se incita a los sectores académicos a la cooperación multidisciplinaria que permita el desarrollo primario de fármacos que puedan luego ser desarrollados por la industria.

I Congreso Centroamericano de Productos Naturales Medicinales Guatemala, 20-23 de abril 2015 congresocpnm@gmail.com