Esferocitosis hereditaria Bioq. Aliano Analía Bioq. Fanessi Viviana Experiencia en el Hospital Posadas

Introducción: Anemias hemolíticas Las anemias hemolíticas (AH) resultan de una menor sobrevida eritrocitaria. Características: Acumulación productos degradación de Hb Aumento actividad médula ósea anemias regenerativas

Clasificación de las Anemias Hemolíticas 1. Por defectos corpusculares Hereditarios Anormalidades de membrana: Esferocitosis Hereditaria, Eliptocitosis, etc Anormalidades de la hemoglobina Estructurales : Hb S, Hb C, etc Velocidad de síntesis: Talasemias Anormalidades del metabolismo: deficit de G6PDH, PK, etc. Adquiridos Hemoglobinuria Paroxística Nocturna 2. Por defectos extra corpusculares (adquiridos) Por anticuerpos An Hem autoinmune Idiopáticas Secundarias: Infecciones, drogas, enf hematológicas, colagenopatías An Hem alloinmune: postransfusional, Enf Hemolítica del recién nacido Por traumatismo mecánico Anemia hemolítica microangiopática: SUH, PTT, CID, etc Valvulopatías aórtica Prótesis Valvulares Por tóxicos directos: Infecciones, toxinas, agentes físicos y qcos, venenos serpientes y arañas Por estímulo externo: esfuerzo, quemaduras Por hepatopatía Por hiperesplenismo

Membrana del eritrocito Glicoforina A Glicoforina C Banda 3 Banda 3 Banda 3 Banda 3 p55 Interacciones verticales Adducina 4.2 4.1 Ankirina 4.9 Actina Tropomiosina β Espectrina β α Espectrina Tropomodulina Interacciones horizontales

Esferocitosis Hereditaria(SH) Síndrome caracterizado por: presencia de esferocitos en sangre periférica, anemia, ictericia y esplenomegalia. Expresión heterogénea si consideramos la severidad de la enfermedad, la alteración proteica involucrada y el modo de transmisión.

Antecedentes históricos 1907. Chauffard Aumento de fragilidad osmótica. ”Enfermedad de Minkowsky Chauffard” 1970. Alteraciones proteínas de membrana 1985. Alteraciones moleculares 1890. Wilson. 1871. Vanlair Masius.

Generalidades de la Esferocitosis hereditaria Herencia: 75% Autosómica dominante (AD) 25% 50% Autosómica recesiva (AR) o AD con penetrancia incompleta 50% mutaciones de novo

Epidemiología AH congénita crónica más frecuente en los países occidentales. Mayor incidencia: Norte de Europa y América del norte. Frecuencia: 1/5000 - 1/2000. Argentina: no existen datos de incidencia, pero se sabe que es la anemia hemolítica crónica más frecuente.

Fisiopatología Mecanismos fisiopatológicos Defecto intrínseco de la membrana eritrocitaria Bazo intacto remueve hematíes dañados.

Fisiopatología ↓ S/V Déficit espectrina, prot 4.2 o ankirina ↓pH ↑contacto GR-Macrofago ↓glu ↑(oxidantes) Hemólisis Eritrostasis Secuestro esplénico ↓ S/V ↓ deformabilidad celular Pérdida membrana Condicionamiento esplénico Déficit de banda 3 Esferocitos en frotis de sangre periférica Adaptado de Narla Mohandas, Silverio Perrotta, Patrick G Gallagher. Hereditary spherocytosis. www.thelancet.com Vol 372 October 18, 2008

Causas de Esferocitosis Hereditaria N. Mohandas, S. Perrotta, P.Gallagher. Hereditary spherocytosis. www.thelancet.com. 18/10/08

Clasificación de Esferocitosis hereditaria Actualmente la clasificación se basa en los niveles de Hb: Severa: Hb<8 g/l Moderada: 8-10 g/l Mínima: 10<Hb<11.5 g/l en ♀ 10<Hb<13.5 g/l en ♂ N. Mohandas, S. Perrotta, P.Gallagher. Hereditary spherocytosis. www.thelancet.com. 18/10/08

Complicaciones Crisis hemolíticas, muy frecuentes durante las infecciones virales, rara vez son graves. Crisis aplásticas por infección de parvovirus B19. Crisis megaloblásticas resultan de la deficiencia de ácido fólico, en particular en las embarazadas.

Complicaciones Poco frecuente: Litiasis vesicular, colelitiasis u obstrucción biliar. Poco frecuente: Ulceras recurrentes o dermatitis en miembros inferiores, hemopoyesis extramedular, gota, retraso en crecimiento y desarrollo sexual.

Diagnóstico ANTECEDENTES FAMILIARES CLINICA LABORATORIO

Anemias Hemolíticas ↓ Hb + ↑ Reticulocitos Hemólisis Intravascular Hemólisis extravascular ↑ Hb plasmática, LDH ↑ Bilirrubina Total e Indirecta ↓ Haptoglobina y hemopexina ↑ Estercobilinógeno fecal Hemoglobinuria y hemosiderinuria ↑ Urobilina en orina Prueba de Coombs Directa Negativa Positiva Historia familiar!!! Anemias hemolíticas Inmunes FROTIS (morfología GR) Esferocitos Inespecífica Dianocitos, falciformes Eliptocitos Hipocromía, microcitos Investigar TODAS las Investigar Membranopatías DETERMINACIONES Hemoglobinopatías

LABORATORIO Específico General Específico Parámetros de Anemia Hemólisis Estudios de screening y confirmatorios

Laboratorio General Alteraciones indicativas de hemólisis Extravascular: Bilirrubina Indirecta, Urobilinógeno fecal, Urobilina Intravascular: Hemoglobinemia, LDH, disminución de Haptoglobina, Hemoglobinuria, Hemosiderinuria Prueba de Coombs directa: negativa Adultos: no descartar la posibilidad de una anemia hereditaria Reticulocitos: aumentados Tener en cuenta los valores de referencia adecuados Edad gestacional: > %Retic a menor edad gestacional Días de vida: valores elevados al nacimiento hasta el 3º día Hemograma: VCM, HCM, ADE, CHCM. FROTIS: MORFOLOGIA!!

Déficit de β-espectrina FROTIS: MORFOLOGÍA!! Esferocitos Sin alteraciones Déficit de β-espectrina Déficit banda 3 Esferoacantocitos Hongos

LABORATORIO General Específico Parámetros de Anemia Hemólisis Estudios de screening y confirmatorios

Estudios de Membrana Screening Confirmatorios Hemólisis aumentada Prueba de Autohemólisis Test de glicerol acidificado Pink test Fragilidad osmótica aumentada Curvas de fragilidad osmótica Técnica de Dacie Fragilímetro Nefelometría Criohemólisis hipertónica Deformabilidad celular alterada Ectacitometría Reoscopía Otras Citometría de flujo Determinación cuantitativa de las proteínas de membrana Electroforesis PAGE-SDS Electroforesis bidimensional Electroforesis capilar Análisis genético

Prueba de Autohemólisis Fundamento: Mide la capacidad de los hematíes para mantener su integridad in vitro después de 48 hs de incubación a 37ºC en su a su propio plasma.

Prueba de Autohemólisis Técnica : Se incuba 48 Hs sangre heparinizada estéril con y sin agregado de glucosa a 37ºC Se evalúa % hemólisis leyendo absorbancia a 540nm. Desventajas Volumen relativamente grande de muestra Posibilidad de contaminación  duplicados de cada tubo. Límites de % hemólisis normales Sin glucosa añadida: 0.2-2 % Con glucosa añadida: 0-0.9%

Curva de fragilidad osmótica Fundamento: Se suspenden los eritrocitos en soluciones de hipotonía creciente de NaCl. (0 a 0.9% NaCl) El H2O penetra en el interior del GR para equilibrar su presión osmótica con la del medio La célula se vuelve esférica y al alcanzar un volumen crítico se rompe. En la SH el Vc del esferocito <<<< Vc glóbulo rojo

Curva de fragilidad osmótica CONTROL Técnica Eritrocitos + soluciones de hipotonía creciente de NaCl. Incubación 20 min a TA se centrifugan los tubos y se cuantifica el grado de hemólisis. PACIENTE

Curva de fragilidad osmótica Población condicionada Coincidente con la normal I Resistencia mínima VN: 0.48-0.51 gr% ClNa Fragilidad corpuscular media VN: 0.43-0.475 gr ClNa Resistencia máxima VN: 0.30-0.33 gr.% ClNa

Curva de fragilidad osmótica diferida Incremento de la sensibilidad, preincubación de las células 24hs en soluciones de distinta concentración salina estériles a 37ºC. Se produce stress metabólico de los eritrocitos y maduración de reticulocitos que son osmoticamente más resistentes, acentuando las diferencias entre las poblaciones. Hipocromía debido a una ferropénia latente puede enmascarar un descenso de la resistencia osmótica.

Curva de fragilidad osmótica basal y diferida Gráfico: % Hemólisis vs [ClNa] Gráfico : Incremento del % Hemólisis vs [ClNa]

Criohemólisis hipertónica Fundamento: Evalúa el efecto de un cambio brusco de temperatura en los eritrocitos suspendidos en un medio hipertónico. No depende de la relación S/V, sino de la integridad de las proteínas de membrana.

Criohemólisis hipertónica Se suspenden los eritrocitos en solución hipertónica de sucrosa a 37ºC durante 10 minutos y luego igual tiempo a 0º C. Se cuantifica el % hemólisis en el sobrenadante. Valores de corte : Criohemólisis > 2,8 % E: 95 % y S: 79 % Ventajas:Arroja resultados normales en la AHAI American Journal of Haematology 58.206-212 (1996)

Citometría de flujo Fundamento: evalúa la intensidad de la fluorescencia que presentan los eritrocitos intactos luego de ser incubados con el colorante 5-eosina-maleimida (5-EMA) que se une covalentemente en un 80% al residuo Lys de la proteína banda 3, el 20% a glicoproteínas del grupo Rh. Cada muestra de paciente se debe correr con 6 controles normales y se informa como disminución de la fluorescencia del histograma

Citometría de flujo Histogramas de fluorescencia Permiten diferenciar SH, EH y PPH Esferocitosis (SH) Reducción de fluorescencia Eliptocitosis (EH) No presenta diferencias entre la población eritrociatria normal Piropoiquilocitosis (PPH) Doble pico de fluorescencia British Journal of Haematology 2000,924-933

Citometría de flujo Ventajas: Rapidez en la obtención de resultados Pequeño volumen de muestra Permite diferenciar los esferocitos presentes en EH de los presentes en AHAI Sensibilidad del 92.7% y una especificidad del 99.1% reportada por bibliografía.

Electroforesis SDS-PAGE de membrana Método de referencia para identificación de proteína deficiente. Tiene bajo porcentaje de recuperación. Permite diferenciar la presencia o no de proteínas del citoesqueleto eritrocitario. Permite confirmar el diagnóstico de EH en : Aquellos casos en que no haya historia familiar positiva Cuando las pruebas de screening no son concluyentes Cuando la clínica que presenta el paciente no guarda relación con la que presenta el resto del grupo familiar. Clin. Lab, Haem. 25,373-376

Tratamiento Esplenectomía Las HS deficientes en banda 3 no se beneficiarían con la esplenectomía. Blood 2002; 100: 2208-2215 Riesgos : 3 semanas antes de la cirugía, vacuna para Neumococo, Haemophilus,Meningococo , Influenza, Hepatitis A y B Transfusión de paquete globular en crisis : 1) megaloblástica, 2) hemolítica 3) aplásica Suplementar con ácido fólico

Membranopatía Hereditaria Cuadro clínico Parámetros de laboratorio general Historia familiar positiva No se requieren estudios adicionales Bolton-Maggs PH, Br. J Haematol. 2004 36

Conclusiones El 75 % de las EH pueden ser diagnosticadas con: Cuadro clínico Parámetros de laboratorio general Historia familiar positiva De las restantes, el 66 % pueden diagnosticarse mediante estudios confirmatorios simples: Prueba de autohemólisis Curvas de Fragilidad eritrocitaria Criohemólisis hipertónica Muy pocas veces se requieren estudios específicos para arribar al diagnóstico: Electroforesis de membrana (PAGE-SDS) ¿Valor pronóstico? Análisis genético Documentar mutaciones “de novo” 37

Población estudiada

Resultados

Resultados

Resultados

Conclusiones del trabajo Recalcamos la utilidad de realizar varias pruebas, no todas son simultáneamente positivas. EMA-FC y CH test fáciles de ejecutar, con mayor sensibilidad que otros test para diagnóstico de HS. Incorporación nuevo parámetro para evaluar la citometría, que es el % incremento del CV. Proteínas deficientes más frecuentes en la población estudiada son espectrina y ankirina. Estudio extendido a los familiares del paciente permiten establecer el diagnóstico de esferocitosis asintomáticas y detectar portadores sanos.

Bibliografía Sara Streichman* and Yehudit Gescheidt . Cryohemolysis for the Detection of Hereditary Spherocytosis: Correlation Studies With Osmotic Fragility and Autohemolysis. American Journal of Hematology 58:206–212 (1998) May-Jean King, Judith Behrens, Chris Rogers, Clare Flynn, David Greenwood and Keith Chambers. Rapid flow cytometric test for the diagnosis of membrane cytoskeleton-associated haemolytic anemia. British Journal of Haematology, 2000, 111, 924±933. P. S. Kedar, R. B. Colah, S. Kulkarni, K. Ghosh, D. Mohanty. Experience with eosin-5¢- maleimide as a diagnostic tool for red cell membrane cytoskeleton disorders. Clin. Lab. Haem. 2003, 25, 373–376 Walter E. Rodríguez*, German F. Sáenz*, Jessie Orlich. Diagnostico de la esferocitosis hereditaria con pruebas de glicerolisis María del Pilar Ricard Andrés. La esferocitosis hereditaria y su diagnóstico en la práctica clínica. Universidad complutense de Madrid facultad de medicina departamento de medicina. Madrid, 1993.

Bibliografía Narla Mohandas, Silverio Perrotta, Patrick G Gallagher. Hereditary spherocytosis. www.thelancet.com Vol 372 October 18, 2008 P. H. B. Bolton-Maggs, R. F. Stevens2, N. J. Dodd3, G. Lamont4, P. Tittensor5and M.-J. King on behalf of the General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis . 2004 Blackwell Publishing Ltd, British Journal of Haematology, 126, 455–474 Mariagabriella Mariani, Wilma Barcellini, Cristina Vercellati, Anna Paola Marcello,Elisa Fermo, Paola Pedotti, Carla Boschetti, and Alberto Zanella. Clinical and hematologic features of 300 patients affected by hereditary spherocytosis grouped according to the type of the membrane protein defect. Published Ahead of Print on July 18, 2008, as doi:10.3324/haematol.12546 Crisp R, Solari L, Chamorro M, Gammela D, Vota D, Garcia E, Venegas B, Miguez G, Schvartzman G, Caldarola S, Ricchieri C, Alfomso G, Nesse A, Donato H. Hereditary spherocytosis: relationship between clinical outcome, diagnostic test results and membrane protein deficiency. A prospedtive study from argentina. Poster presentedat EHA 15 on: 1012--P Renée Crisp 12th June 2010

Agradecimientos Dra. Renée Crisp del Servicio Médico de Hematología del Hospital Profesionales del Sector de Citometría de flujo del Laboratorio Central Dra. Sandra Cozzarín y demás profesionales y técnicos del Sector de Hematología del Laboratorio Central Profesionales y técnicos de Endocrinología y Bacteriología Nuestros compañeros de Residencia

GRACIAS!!!!