Diagnóstico de Laboratorio Enfermedad de Chagas Diagnóstico de Laboratorio Dr. Guillermo G. Nuñez Inmunoserología y Autoinmunidad

amastigote trypomastigote ESTADIOS EVOLUTIVOS T. cruzi epimastigote

Ciclo heteroxénico

Mecanismos de Infección VECTORIAL TRANSPLACENTARIA TRANSFUSIONAL TRANSPLANTES

ETAPA AGUDA Curso clínico Signo de Romaña Fiebre Hepato/esplenomegalia Período de incubación: ~7 días  Generalmente asintomática  Primoinfección en niños de zonas endémicas Signo de Romaña Fiebre Hepato/esplenomegalia Encefalitis  Forma sintomática 40-60 *Alta parasitemia

ETAPA LATENTE *Período de 30-40 años *Equilibrio entre la patología parasitaria y la respuesta inmune *Asintomático Inmunidad Concomitante *Baja parasitemia *Alta producción de Anticuerpos

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

Infección Aguda Infección Crónica clínica clínica Infección Intensidad de respuesta Anti-T.cruzi IgM Período incubación Anti-T.cruzi IgG parasitemia Infección 1-2 semanas 9-10 semanas

TRATAMIENTO ETIOLOGICO Infección Aguda Infección Crónica clínica TRATAMIENTO ETIOLOGICO Anti-T.cruzi IgG parasitemia Intensidad de respuesta Transmisión vectorial Transmisión congénita Período incubación VER NOTAS Infección 1-2 semanas 8-10 semanas >1 año 3-5 años

Fase aguda -Reactivaciones METODOS PARASITÓLOGICOS Fase aguda -Reactivaciones Xenodiagnóstico Microhematocrito Hemocultivo Strout Sensibilidad 100% // PARASITOS VIVOS-MUESTRA FRESCA Xeno y HEMO amplifican CONDICIONES DE TOMA DE MUESTRA

Tripomastigote sanguíneo –(May-Grünwald-Giemsa)

METODOS SEROLÓGICOS Antígenos solubles de membrana y citoplasmáticos Etapas latente y crónica – Screening bancos de sangre HAI Antígenos solubles de membrana y citoplasmáticos ELISA Antígenos recombinantes (SAPA) IFI Epimastigotes enteros MACHADO GUERREIRO –NO !!!!!!!!!! METODOS DE INTERACCION PRIMARIA Y SECUNDARIA

Sensibilidad analítica Hemaglutinación Indirecta (HAI) IgGAM Económico Sensibilidad analítica NO automatizable

Sensibilidad analítica Enzimoinmunoensayo (ELISA) IgG IgM Económico Sensibilidad analítica Automatizable Reproducible

Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) IgG IgM Requiere microscopía de fluorescencia Sensibilidad analítica Reproducible

Inmunoensayo quimioluminiscente (CMIA) CMIA Antígenos recombinantes

conjugado muestra TcF-FP3 FP6-FP10 h. H2O2 Micropartículas-Ags

Requiere tecnología y experiencia Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Es la amplificación enzimática de un fragmento de ADN flanqueado por dos secuencias de oligonucleótidos que hibridan en la cadena complementaria de la molécula molde que se va a amplificar (cebadores o “primer”) y que son utilizados por una DNA polimerasa termoresistente para copiar la secuencia de la misma. kDNA o sDNA costosa Requiere tecnología y experiencia Sensible y específica No dependiente de Estado Inmunitario desnaturalización extensión hibridización

PCR convencional PCR En Tiempo Real extracción ADN total nucleótidos dATP, dGTP, dCTP, dTTP Taq DNA-polimerasa F primers R PCR convencional PCR En Tiempo Real

Ciclado (Amplificación) Desnaturalización Ciclado (Amplificación) 56°C Alineamiento 72°C Elongación

Schijman et al. PLoS Negl Trop Dis. 2011 Enero; 5(1): 931

Técnica de diagnóstico Formas clínicas de la Enfermedad de Chagas AGUDA LATENTE-CRÓNICA CONGÉNITA GOTA FRESCA + - GOTA GRUESA ++ MICROCONCENTRACION +++ STROUT HEMOCULTIVO -/+ XENODIAGNÓSTICO PCR ++++ SEROLOGÍA (inicio) + (>20 días) IgG materna<6 meses IgM niño

Algoritmo diagnóstico ANTECEDENTE EPIDEMIOLOGICO -Transmisión vectorial -Transfusión sanguínea -Transmisión congénita -Trasplante de órganos INFECCION POCO PROBABLE no si SINTOMÁTICO ASINTOMÁTICO FORMA AGUDA Búsqueda de tripanosomas en sangre --------------------------------------------------- Métodos parasitológicos: Xenodiagnóstico-Strout-Microhematocrito Hemocultivo -PCR (-) FORMA CRONICA Búsqueda de Anticuerpos --------------------------------------------------- Métodos Serológicos: HAI-ELISA-IFI Acs totales-IgG-IgM (-) DIAGNOSTICO IMPROBABLE (+) dos tests (-) Xenodiagnóstico PCR Seguimiento clínico (+) DIAGNÓSTICO CONFIRMADO

IgG >basal IgG ≤basal CONFIRMA CASO (tratamiento) NO CONFIRMA CASO GESTANTE CHAGÁSICA RECIEN NACIDO BUSQUEDA DEL PARÁSITO -Microconcentración -PCR BUSQUEDA DE ANTICUERPOS (IgG) -ELISA -IFI (titulación del suero) CONTROL SEROLÓGICO A LOS 3, 6 y 9 meses -ELISA -IFI (titulación del suero) IgG >basal IgG ≤basal CONFIRMA CASO (tratamiento) NO CONFIRMA CASO

El problema de Inmunorreactividad Cruzada…

Enfermedad de Chagas Leishmaniosis

Familia Trypanosomatidae ANTÍGENOS COMPARTIDOS Trypanosoma cruzi (tripomastigotes) Leishmania spp (promastigotes) Familia Trypanosomatidae ANTÍGENOS COMPARTIDOS

LABORATORIO CLÍNICA DIAGNÓSTICO DE CERTEZA

Muchas gracias