La industria láctea y los bacteriofagos: tópicos de interés actual Andrea Quiberoni Workshop de Agroalimentos, Centro Binacional Argentino Uruguayo en Agroalimentos Buenos Aires, 25 y 26 de octubre de 2012

Instituto de Lactología Industrial (INLAIN, UNL-CONICET) Bacterias probióticas Dr. Jorge Reinheimer Fagos en la industria láctea TECNOLOGÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA MICROBIOLOGÍA

Bacteriofagos Industria fermentativa La bioconversión de sustratos en compuestos de mayor valor agregado es el proceso básico de una amplia variedad de industrias Cualquier población bacteriana es susceptible a infecciones fágicas Las bacterias representan el pilar fundamental de los procesos La mayoría de las industrias fermentativas experimentan contaminaciones fágicas Graves consecuencias de estas infecciones para todos los sectores industriales (elevados costos y tiempo para identificar el origen e implementar medidas correctivas) Bacteriofagos Industria fermentativa

Infecciones fágicas en la industria fermentativa (Emond & Moineau, 2007) Infecciones fágicas en la industria fermentativa

Infecciones fágicas en la industria fermentativa (Emond & Moineau, 2007)

PRÁCTICAMENTE INEVITABLE PRESENCIA DE FAGOS EN EL AMBIENTE INDUSTRIAL Los grandes volúmenes de leche cruda procesados diariamente constituyen la vía principal de ingreso de fagos a las plantas La elevada frecuencia de mutación es origen de creciente diversidad Entre el 0,1 y el 10% de los batchs están comprometidos por las infecciones Bacteriofagos Industria láctea fermentativa PRÁCTICAMENTE INEVITABLE PRESENCIA DE FAGOS EN EL AMBIENTE INDUSTRIAL

(incluye especies probióticas) Se han aislado fagos específicos para todos los géneros de bacterias lácticas (BAL) que utiliza la industria Starters para elaboración de quesos duros y leches fermentadas Lactobacillus (incluye especies probióticas) BAL más ampliamente utilizada como starter (nivel mundial) Lactococcus Starters para elaboración de leches fermentadas y quesos Streptococcus thermophilus Leuconostoc Starters para elaboración de quesos azules Bacteriofagos Industria láctea fermentativa

Células de Lactobacillus sp. infectadas por un fago Lisis celular 90 min después de la infección

Acidificación en leche: Lb. helveticus en presencia de fagos Fallas en el proceso de acidificación Ausencia de cultivos lácticos y probióticos CONSECUENCIAS 9

Bacteriofagos Industria láctea fermentativa QUESERÍAS LECHES FERMENTADAS QUESERÍAS Calentamiento de la leche a mayor temperatura (90°C), Proceso relativamente aséptico, Ausencia de drenaje y circulación de suero. Calentamiento suave de la materia prima (63°C, 72°C), Numerosas etapas (utensilios, operarios), Separación de suero y generación de bioaerosoles. ELEVADA FRECUENCIA DE INFECCIONES FÁGICAS BAJA FRECUENCIA DE INFECCIONES FÁGICAS Bacteriofagos Industria láctea fermentativa CULTIVOS INICIADORES LECHE CRUDA RUPTURA DE BARRERAS FÍSICAS FAGOS

Bacteriofagos Industria láctea fermentativa PRODUCTOS LÁCTEOS PROBIÓTICOS ¿VÍAS DE INGRESO? Procesos altamente controlados (microbiológica y tecnológicamente), Empleo de cepas ‘únicas’ y especializadas, Importantes inversiones en I+D. FAGOS ELEVADA FRECUENCIA DE INFECCIONES FÁGICAS Bacteriofagos Industria láctea fermentativa

Los bacteriofagos en la industria láctea Estrategias para disminuir el riesgo de infecciones Fermentaciones lácticas Tratamientos térmicos de la materia prima Empleo de cultivos de inoculación directa Empleo de medios inhibidores de fagos (PIM) Programas de rotación de cultivos Higiene y diseño de la planta Empleo de cultivos multicepa Empleo de cepas con fagorresistencia mejorada

Bacteriofagos Industria láctea fermentativa 1. Mejoramiento de la fagorresistencia de cepas a través de herramientas naturales 2. Termorresistencia extrema de fagos: implicancias tecnológicas y analíticas 3. Infecciones fágicas en lactobacilos probióticos 4. Inactivación fágica: diseño de nuevas tecnologías 5. Secuenciación genómica y proteómica

GRUPO DE TRABAJO Mag. Viviana Suárez Dra. Ma. Luján Capra Dra. Daniela Guglielmotti Dr. Diego Mercanti Ing. Mariángeles Briggiler Marcó Lic. Silvina Pujato Dr. Jorge Reinheimer Dra. Andrea Quiberoni GRUPO DE TRABAJO Prof. Hans-Wolfgang Ackermann Prof. Sylvain Moineau Dr. Orlando Alfano Tec. Antonio Negro Prof. Horst Neve Prof. Zeynep Atamer

(Briggiler Marcó et al. 2011) 1. Mejoramiento de la fagorresistencia Empleo de herramientas naturales OBJETIVOS Aislar mutantes espontáneos fagorresistentes (idénticas propiedades a la cepa madre) para su uso como fermentos en la elaboración de productos lácteos. Lb. casei / paracasei (Capra et al. 2011) (Briggiler Marcó et al. 2011) RESULTADOS Variantes útiles, sin restricciones legales. Interesantes candidatos para elaboración de productos lácteos probióticos (“strain claims”). S. thermophilus Lb. helveticus Lb. plantarum Lb. delbrueckii (Binetti et al. 2007) (Quiberoni et al. 1998) (Guglielmotti et al. 2006)

(Capra et al. 2009, Mercanti et al. 2011) Aumento y diversificación de poblaciones fágicas que resisten los tratamientos térmicos (Capra et al. 2009, Mercanti et al. 2011) Lactobacillus (Binetti et al. 2000) Streptococcus thermophilus (Suárez and Reinheimer 2002, Müller-Merbach et al. 2005, Atamer et al. 2009 Lactococcus lactis (Atamer et al. 2011) Leuconostoc 2. Termorresistencia extrema de fagos Implicancias tecnológicas y analíticas

2. Termorresistencia extrema de fagos TECNOLÓGICAS ANALÍTICAS Fagos vehiculizados en la leche cruda (101-104 UFP/ml), Fagos que resisten los tratamientos térmicos, Contaminación del ambiente (planta, laboratorios) y de productos. Muestras conteniendo elevados niveles de fagos, Mayor frecuencia de aislamiento de fagos termorresistentes, Inconvenientes durante los análisis de laboratorio. 2. Termorresistencia extrema de fagos Implicancias tecnológicas y analíticas TECNOLOGÍAS ALTERNATIVAS PARA DESINFECCIÓN ACTUALIZACIÓN DE LAS METODOLOGÍAS ANALÍTICAS

3. Infecciones fágicas en lactobacilos probióticos Estudios moleculares de estas especies demostraron que los profagos son muy frecuentes Lb. casei / paracasei (Lo et al. 2005; Ventura et al. 2006; Capra et al. 2008) Lb. johnsonii (Ventura et al. 2003; Denou et al. 2008) Lb. plantarum (Ventura et al. 2003) Lb. rhamosus (Brandt & Alatossava 2003; Durmaz et al. 2008) (Ventura et al. 2006) Lb. gasseri 3. Infecciones fágicas en lactobacilos probióticos

3. Infecciones fágicas en lactobacilos probióticos Estudios para dilucidar su rol en la evolución de PROFAGOS EN BACTERIAS PROBIÓTICAS (Lepage et al., 2008; Alemayehu et al. 2009) No se consideran entidades inertes en el cromosoma bacteriano Cepas hospedadoras lisógenas Equilibrio del ecosistema intestinal Fagos virulentos en ambientes industriales 3. Infecciones fágicas en lactobacilos probióticos ¿Antagonistas de los efectos benéficos? ¿Co-responsables de los efectos benéficos?

Equipos para purificación de aire La fotocatálisis (UV/TiO2) es una alternativa atractiva para la desinfección del aire ambiental Potencialidad de inactivación viral en bioaerosoles (principal via de dispersión de fagos en el ambiente industrial) POTENCIALIDAD DE APLICACIÓN Inactivación de una amplia diversidad de fagos Tecnología eficiente y segura (UV-A) Posibilidad de aplicación continua en ambientes de planta y laboratorio Mecanismos de inactivación fágica INVESTIGACIONES EN CURSO Diseño y adaptación de equipos para uso industrial Ensayo de un prototipo a escala de laboratorio Equipos para purificación de aire 4. Inactivación fágica Diseño de nuevas tecnologías

(Briggiler Marcó et al., 2012) OBJETIVOS Aumentar el conocimiento sobre diversidad y evolución para fagos de bacterias lácticas y probióticas Lb. casei / paracasei Lb. plantarum 5. Secuenciación genómica y proteómica (Briggiler Marcó et al., 2012)

Los bacteriofagos Entidades biológicas más abundantes sobre el planeta (1030 – 1032 partículas fágicas) Pool de agentes biológicos con potencialidad inexplorada REGULACIÓN DE POBLACIONES BACTERIANAS EVOLUCIÓN DEL PLANETA