EL ANALISIS DE SEMEN HUMANO: ACTUALIZACION DEL MANUAL DE LA OMS 2010. CONGRESO INTERNACIONAL DE QUIMICOS FARMACEUTICOS BIOLOGOS 2011. UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON. Monterrey, Nuevo León a 23 de Agosto de 2011. EL ANALISIS DE SEMEN HUMANO: ACTUALIZACION DEL MANUAL DE LA OMS 2010. Biol. Gerardo Cerezo Parra Director de LABORATORIO FERTIMEXICO S.A. DE C.V. Director de PRO-SEMEN. Secretario General de PLEAS. México D. F. www.analisisdesemen.com.mx

IMPORTANCIA DEL ANALISIS DEL SEMEN. El análisis de semen nos proporciona información esencial sobre el estado clínico del individuo. Toda alteración de la función endocrina o exocrina del testículo se refleja en el análisis de semen, ya sea en sus aspectos morfológicos y/o funcionales. 2

LA CALIDAD DEL SEMEN La calidad del eyaculado depende de la movilidad, vitalidad, concentración, morfología y el volumen (Fluidos seminales), estos son importantes para la función del espermatozoide y que logre la fertilización. La calidad del eyaculado también va a depender de la forma en que se obtenga, el lugar (Zavos y Goodpasture, 1989), la actividad sexual (Cooper et al., 1993), la edad del paciente (Ng et al., 2004), el tamaño del testículo (Holstein et al., 2003), estaciones del año y los días de abstinencia sexual (Cooper et al., 1993) (Tyler et al., 1982a). 3

EL SEMEN HUMANO 70% 5 % lubricación 20% 5 % 4

¿Cuál es el problema? No se ha logrado una estandarización del Análisis de semen. Se han encontrado variabilidad en los resultados de análisis de semen entre los laboratorios (Keel B.A. et. al. 2000, Auger J. et. al. 2000, Björndahl L. 2002). En muchos casos existe falta de control de calidad en los laboratorios.

Génesis del nuevo Manual 2010. 1999 Génesis del nuevo Manual 2010. 2002 Manual de Análisis Básico 2002 NAFA - ESHRE

¿Cuántas Muestras Analizar? -Es imposible caracterizar la calidad del semen masculino al evaluar solo 1 muestra del paciente. -Es recomendable examinar 2 o 3 muestras para obtener datos confiables y una media. (Carlsen et al., 2004 Castilla et al., 2006).

AREA ESPECIAL PARA COLECCION DE LAS MUESTRAS DE SEMEN -Área Privada y cercana al laboratorio. -Limitar la exposición del semen a fluctuaciones de temperatura. -Darle las instrucciones precisas al paciente: Colectar la muestra completa. 2) Comunicarnos si perdió alguna fracción del eyaculado. 9 9

INSTRUCCIONES AL PACIENTE -Abstinencia Sexual de 2-7 días. -Aseo con agua y jabón de genitales. -Toma de muestra en el laboratorio. -Colección de muestra por masturbación. -No se permite el coito interrumpido. -No se debe perder ninguna fracción del eyaculado. 10 10

COLECCION DEL EYACULADO -COLECCIÓN DE LA MUESTRA CON CONDON ESPECIAL: 1) Incapacidad para colectar la muestra por masturbación en el laboratorio y en casa. 2) Darle al paciente las indicaciones para la colección de la muestra de semen con condón. 3) Utilizar condones especiales. 4) Registrar la hora de la colección del semen. 5) Entregar la muestra al laboratorio dentro de la hora después de la colección de la muestra de semen. 6) Mantener la muestra de semen entre 20 y 37°C durante el transporte al laboratorio. 11 11

LICUEFACCION Proceso en el cual el semen pasa de un estado hiperviscoso a un estado liquido (manejable). -El semen generalmente se licua dentro de los primeros 15 minutos. -El semen puede contener gránulos gelatinosos. PARAMETRO VALOR DE REFERENCIA LICUEFACCION 10 – 60 MIN. 12 12

EVALUACION DEL VOLUMEN Transferencia al recipiente de recolección Transferencia desde el recipiente de recolección con pipeta o decantando a un cilindro graduado: • Falsos volúmenes bajos • ­0.4 a ­0.8 ml (14%)

Medición indirecta a partir del peso, asumiendo que la densidad del semen es 1g/ml (1,014g/ml). 1)Pesar el recipiente (con la etiqueta). 2)Pesar el recipiente con el semen (g). 3)Calcular la diferencia de peso (g = ml). Valor de referencia: >1.5 ml. Menor a esto: Hipospermia.

APARIENCIA VALOR DE REFERENCIA: GRIS OPALESCENTE -Menos Opaco: Concentración Disminuida. -Rojo ó Marrón: Hemospermia. -Amarillo: Vitaminas. www.analisisdesemen.com.mx 15 15

VISCOSIDAD VALOR DE REFERENCIA: VISCOSIDAD NORMAL : Se forman gotas de semen al dejarlo caer. VISCOSIDAD AUMENTADA:: Se forma una filancia mayor a 2 cm. Nota 1.- La viscosidad puede interferir con la determinación de la movilidad, concentración, detención de anticuerpos antiespermatozoides. 16 16

pH Refleja el balance entre las vesículas seminales y la próstata. PARAMETRO VALOR DE REFERENCIA pH >7.2 El pH normal del semen recién eyaculado debe ser mayor a 7.2; Con el transcurso del tiempo el pH del semen se alcaliniza, es por eso que es preferible medirlo inmediatamente después de la licuefacción (si sucede en los primeros 30 minutos), pero si sucede hasta la hora el pH es cambiado por la perdida de CO2. 17 17

Análisis del semen: representación de una alícuota El semen es viscoso Área 1: -Elevada concentración de espermatozoides. -Espermatozoides rápidos. -Buena morfología. Área 2 : -Baja concentración de espermatozoides. -Espermatozoides lentos. -Mala morfología. ¡MEZCLAR BIEN LA MUESTRA.! 18 18

Movilidad espermática: profundidad de la cámara Contar a Tª ambiente o 37ºC en cámaras con una profundidad de ~20 µm, para permitir el movimiento libre La profundidad (D,µm) es el volumen (V, µl=mm³) dividido por el área (A, mm²) Movilidad espermática: profundidad de la cámara Contar 2 x 200 espermatozoides (si es posible) en al menos 5 campos diferentes Usar un ocular reticulado para limitar el área examinada evitando los limites del cubreobjetos a) b) > 5 mm

CATEGORIAS DE MOVILIDAD: Movilidad Progresiva (PR): Espermatozoide con movimiento activo; lineal o en círculos grandes independientemente de la velocidad. Movilidad no Progresiva (NP): Movimientos “in situ”: Movimientos en el mismo lugar (sin desplazamiento).nado en círculos pequeños, la fuerza del flagelo no puede desplazar a la cabeza del espermatozoide o cuando solo el flagelo se observa. Inmóviles (IM): Sin movimiento. Valor de referencia: >32% PR. Menor a esto: Astenozoospermia. 20 20

Aplicable para movilidad, vitalidad y morfología. Tabla 1.- Intervalos de confianza del 95% aproximadamente para las diferencias entre dos porcentajes determinados de conteos por duplicado de 200 (400 espermatozoides totales contados) 0 400 espermatozoides. Aplicable para movilidad, vitalidad y morfología. PORCENTAJE PROMEDIO DIFERENCIA MAXIMA ACEPTABLE DIFERENCIA MAXIMA 1 66-76 9 2 77-83 8 3 84-88 7 3-4 4 89-92 6 5-7 5 93-95 8-11 96-97 12-16 98 17-23 99 24-34 100 35-65 10 www.analisisdesemen.com.mx 21 21

Agregaciones: Adherencia de espermatozoides inmóviles o móviles a células no espermáticas o detritos . Aglutinaciones: Espermatozoides móviles adheridos a otros espermatozoides móviles. www.analisisdesemen.com.mx 22 22

PRUEBA DE VIABILIDAD USANDO EOSINA-NIGROSINA Espermatozoides con la membrana de la cabeza intacta: exclusión de colorantes impermeables Ej. Eosina-nigrosina Eosina = colorante no permeable Nigrosina = fondo oscuro Cabeza roja = spz muerto (D1) Cabeza rosa = spz muerto (D2) Cabeza blanca = spz vivo (L) Cuello rosa = spz vivo (L)

EVALUACION DE LA VIABILIDAD -Contar 200 espermatozoides (duplicado de diferentes preparaciones) en un campo de 40X y obtener el porcentaje de vivos y muertos. Eosina Amarillenta VIVO MUERTO www.analisisdesemen.com.mx 24 24

Concentración espermática: cámara Neubauer Improved Cámara de 100 µl de profundidad 9 rejillas de 100nl Rejilla central 25 cuadrados grandes de 4nl Cada cuadrado grande 16 cuadrados pequeños de 250pl •Hacer duplicados de dos diluciones separadas •No llenar ambas cámaras de una dilución •No contar la misma cámara dos veces •Error de muestreo •Error de pipeteo •Error de dilución

¿Qué espermatozoides se cuentan? Contar todos los espermatozoides que estén dentro del cuadro central La línea media muestra el cuadrado relevante : contado : no contado

¿Qué espermatozoides se cuentan? Se cuentan los espermatozoides sólo cuando están sobre las líneas inferiores o izquierdas(“L”) En la línea izquierda En la línea inferior : contado : no contado

PREPARACIÓN DEL FROTIS SECADO AL AIRE FIJACIÓN PAPANICOLAOU TREN CORTO DE TINCIÓN (Papanicolaou modificada o Diff-Quik) PLACAS PRETEÑIDAS

MORFOLOGIA NORMAL DE LA CABEZA Y PIEZA MEDIA

Anormalidades CABEZA CUELLO Y PIEZA MEDIA COLA Grande. Amorfa. Pequeña. Elongada. Piriforme. Doble. Vacuolada. Acrosoma pequeño. Inserción Asimétrica. Cuello Doblado. Gruesa o Irregular. Fina, Gotas Citoplásmica, >1/2 del área de la cabeza. Múltiple. Corta. Doblada. Irregular. Enrollada.

DEFECTO DE CABEZA MACROCEFALO

DEFECTO DE CABEZA PIRIFORME

DEFECTO DE CABEZA TAPERING

DEFECTO DE PIEZA MEDIA PIEZA MEDIA DOBLADA

DEFECTO DE PIEZA MEDIA GOTA CITOPLASMICA

DEFECTO DE FLAGELO FLAGELO ENROLLADO

DEFECTO DE FLAGELO FLAGELO CORTO

ESPERMATOZOIDE NORMAL

EVALUACIÓN DE LA MORFOLOGIA ESPERMATICA Se valora en porcentaje de acuerdo a los siguientes criterios: N = Normales DC = Defectos de cabeza. DPM = Defectos de Pieza Media. DF = Defectos de Flagelo. DG = Residuo Citoplasmático 100X N DC DM DF

TERATOZOOSPERMIA <4% NORMALES O.M.S. 2 ed. 3 ed. 4 ed. 5ed. % >50 >30 >14 >4 TERATOZOOSPERMIA <4% NORMALES

OTRAS CELULAS PRESENTES EN EL SEMEN El semen contiene células diferentes de los espermatozoides como son: células epiteliales del tracto uretral, células inmaduras (células de la espermatogénesis) y leucocitos. A estas células se les llama células redondas y pueden ser reportadas como número de células por campo.

CELULAS EPITELIALES

CELULAS INMADURASY LEUCOCITOS

Programas de Control de Calidad Externo Objetivos: Mejorar los resultados de los laboratorio clínicos, para que puedan ser transferibles. Comprobar el grado de imprecisión de los resultados obtenidos con los métodos analíticos empleados en el propio laboratorio. Comparar la inexactitud de los métodos analíticos propios con la de otros participantes. Apoyar el control de calidad interno.

Análisis de Semen Precisión(CCI) / Exactitud(CCE) NO SI PRECISION NO SI PRECISION: Dispersión de una misma muestra alrededor de su promedio. EXACTITUD: Grado de coherencia entre el valor obtenido y el valor verdadero. de la muestra.

PEEC EN ANALISIS DE SEMEN. ¿Es obligatorio participar? -La NOM-166-SSA1-1997.Para la Organización y Funcionamiento de los laboratorios. 9.2 Deberán participar al menos en un programa de evaluación externa de la calidad en el cual deberán integrar los análisis que realice y que incluya el programa. - La OMS(1999, 2010), Resalta la importancia de participar en PEEC.

PROGRAMAS MUNDIALES DE PEEC EN ANALISIS DE SEMEN. ESQUEMA PAIS Fertility Society of Australia (FSA). Australia United Kingdom National External Quality Assesment Schemes (UKNEQAS). Reino Unido American Association of Bioanalysts (AAB). Estados Unidos Centro de Estudios e Investigación de la Fertilidad (CEIFER). España College of American Pathologists (CAP). European Society of Human Reproduction and Embriology (ESHRE). Europa

Material de referencia del Programa de Control de Calidad Externo de ESHRE*. 1.- Viabilidad (2 muestras). 2.- Morfología (4 muestras). 3.- Concentración (4 muestras). 4.- Movilidad (4 muestras) *European Society of Human Reproduction and Embriology.

PEEC- SEMEN en MEXICO Programa Mexicano de Evaluación Externa de la Calidad en Análisis de Semen (PEEC-SEMEN). En colaboración con: Laboratorio de Andrología del Centro de Andrología y Medicina Sexual, Hospital Universitario. Karolinska, Huddinge, Estocolmo, Suecia.   Dr. Lars Björndahl Director

LIMITES INFERIORES DE REFERENCIA

OMS´5: Valores de referencia para el semen humano Población de referencia Padres (parejas con un embarazo hace ≤ 12 meses N>1600 3 continentes 5 centros Muestra -2-7 días de abstinencia. -Muestras completas. Métodos Recolección, preparación, análisis con metodología de la OMS IQC + EQC – laboratorios controlados Sólo hemocitómetro (ni CASA, ni cámara Makler) Morfología Tygerberg www.analisisdesemen.com.mx 51 51

CONCLUSIONES Los cambios en el manual de laboratorio de la OMS para el examen de semen humano están enfocados a: • Aumentar la exactitud de los datos analíticos • Suministrar más detalles experimentales de métodos comunes. Estos deberían ayudar a mejorar: • La estandarización entre laboratorios. • El valor diagnóstico de los resultados de los análisis de semen. • y llevar a cabo tratamientos terapéuticos. www.analisisdesemen.com.mx 52 52

¡MUCHAS GRACIAS! Biol. Gerardo Cerezo Parra E-mail: info@analisisdesemen.com.mx Web: www.analisisdesemen.com.mx