Métodos y Técnicas de Estudio en Biología Celular Cultivos Celulares Métodos y Técnicas de Estudio en Biología Celular

Objetivos Puntos que deben ser asimilados -Equipo básico de un laboratorio de cultivo celular -Cultivos primarios y líneas estables -Preparación del medio de cultivo -Asepsia en el cuarto de cultivo y esterilidad -Rutina en el mantenimiento de la línea celular estable -Congelación y almacenamiento de las líneas celulares

Equipo Básico de un laboratorio de Cultivo Celular Campana de flujo laminar Baño termostatizado Incubador CO2 Autoclave 5. Nevera y Congelador 6. Microscopio Invertido 7. Micro centrifuga 8. Depósito de Nitrógeno líquido

Cualquier recipiente, herramienta... Debe ser esterilizada Autoclave Cualquier recipiente, herramienta... Debe ser esterilizada

Tanque de Nitrógeno líquido Congelación de líneas estables

Campana de Flujo Laminar Esterilidad!! (no evita contaminación un mal uso)

Incubador CO2 Atmósfera controlada con elevada humedad y tensión de CO2

Micro Centrifuga Suspensiones celulares (lavados, concentrados, subcultivos)

Microscopio Invertido Seguimiento del cultivo: viabilidad, multiplicación, contaminación. Control sobre cambios morfológicos (efectos de hormonas, de tratamientos con medicamentos, de iones, interacciones, etc.

Botellas y Placas de Cultivo

Puntos Importantes Esterilidad Asepsia Hábito de trabajo

Cultivos Primarios (El principio de la historia.....)      A- Aislamiento del tejido     B- Disección/disgregación C- Cultivo celular en recipiente (Placa Petri) (Cultivo primario) Aunque potencialmente se puede obtener un cultivo primario a partir de cualquier tipo de tejido, normalmente los tejidos embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a que su grado de diferenciación es menor y su capacidad de división mayor.

Preparación cultivos

Cultivos secundarios y líneas estables Si uno o varios tipos de células de un cultivo primario se re-siembran (sub-cultivo), el cultivo obtenido se denomina cultivo secundario. La heterogeneidad celular es menor: el medio utilizado determinará qué células se desarrollarán. Las líneas estables son las que se obtienen por sub-cultivo y selección de cultivos secundarios. También se pueden obtener a partir de tejidos tumorales.

Selección de la línea estable

Líneas celulares estables Ventajas Desventajas Control del entorno celular Homogeneidad celular Conocimiento del tipo celular Economía Falta de diferenciación Inestabilidad de la línea (mutaciones DNA)

Medios de Cultivo: Medios Base Medios base: Eagle’s Basal Medium, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), RPMI1640, etc. Contienen: Hidratos de Carbono, ácidos grasos esenciales y otros lípidos, aminoácidos, sales minerales, oligoelementos. *Cada línea celular tiene unos requerimientos que hacen que crezca mejor en un determinado tipo de medio

Medios de Cultivo: Aditivos Antibióticos: estreptomicina (Gram +/-), penicilina (Gram +), amfotericina (levaduras y hongos) Tampón pH: Hepes, bicarbonato, etc. Indicador pH. Suero fetal: Bovino, ovino, humano. 10% (2-50%). Aditivos específicos: Suplemento de piruvato, suplemento de glucosa, etc.

Tamponadores de pH Hepes Buffer tamponador que actúa de manera muy eficiente en el rango 7,2-7,6 *Importancia de la ppCO2 en el mantenimiento del pH H2O + CO2  H2CO3  H+ + HCO3- * Rojo Fenol (Phenol Red-Na) (Indicador de pH)

Propiedades físico-químicos del Medio CO2: Normalmente 5% (2-8% depende de tipo celular y [HCO3-] pH.............................................................(7.0-7.7) Osmolaridad.............................................(290-320) mOsm/Kg Viscosidad................................................ Suero Temperatura............................................. 37ºC (mamífero) (aves: 38,5ºC; epitelio de ratón: 33ºC; insectos: 28ºC)

Test de medio completo con suero Previamente a la realización de experimentos los medios deben ser probados a diferentes niveles. Posible Contaminación Niveles de Proliferación Celular (eficiencia)

Elección del medio de cultivo adecuado a cada línea celular Se deben realizar diferentes pruebas con varios medios de cultivo en la elección del medio más adecuado a las características de nuestra línea. Las pruebas consisten en la realización de diferentes curvas de crecimiento

Conceptos básicos en el mantenimiento de una línea estable Subcultivo Confluencia Tiempo de duplicación Criogenización Ciclo celular: Fases G1,S,G2,M y G0

¿Qué son y cómo se realizan los subcultivos? Objetivos: Propagación de la línea celular Producción de células para la experimentación Usualmente se realizan al llegar a confluencia. Evitar que el medio de cultivo esté agotado.

Curva de Crecimiento (líneas estables): Fases del cultivo Fase de latencia (período lag). Fijación al sustrato e inicio del ciclo celular. Fase de crecimiento exponencial. El número de células se duplica aproximadamente cada 24 horas. Fase de confluencia. Las células del cultivo, que se ha saturado, dejan de dividirse (monocapa: inhibición por contacto; suspensión: consumo del medio). Fase de muerte. Si el cultivo se prolonga por demasiado tiempo, las células entran en una fase de senescencia que termina con la muerte de las células en cultivo.

Subcultivos Celulares

Protocolo Subcultivo Depende de las características de la línea celular con la que se esta trabajando. Células en suspensión Células adheridas al substrato

Células Adheridas Para realizar el subcultivo de células adheridas se debe proceder al levantamiento de las mismas: Tripsinización. Levantamiento Mecánico (raspado). En células en suspensión es suficiente con realizar una dilución en medio nuevo (o bien adición de medio tras centrifugación).

La Fase Experimental Objetivos: Investigación de un fenómeno biológico Estudio de las bases moleculares de una patología Investigación de los mecanismos empleados por los fármacos Estudio de la toxicidad de determinados compuestos Investigación de la estructura y función de macromoléculas y orgánulos celulares

La Fase Experimental Planteamiento: Se cultivan en frascos separados las células control y las células “problema”. Se adiciona un compuesto o se cambian las condiciones experimentales del frasco problema y se mantiene la incubación durante un tiempo (minutos a días). Finalmente se determinan las diferencias entre las células tratadas (problema) y las no tratadas (control). En determinadas ocasiones no se realiza un tratamiento en paralelo de células en diferentes frascos, sino un tratamiento secuencial de las células control (antes y después de ciertas condiciones).

La Fase Experimental Investigación: Es la fase en la que utilizando una técnica experimental determinamos algún fenómeno celular. Podemos estudiar el efecto de una hormona sobre la localización de proteínas celulares mediante microscopia confocal (células vivas), podemos determinar mediante RT-PCR o western blot la expresión de un determinado gen o hacer un estudio completo de la expresión génica mediante proteómica y/o genómica (células muertas).

La Fase Experimental Transfección: Introducción de DNA externo con un vector de expresión. TIPOS: Transitoria o estable. MÉTODOS: Electroporación Fosfato cálcico Lipofección Microinyección