Productos proteolíticos circulantes de carboxipeptidasa N para la detección temprana del cáncer de mama Y. Li, Y. Li, T. Chen, A.S. Kuklina, P. Bernard, F.J. Esteva, H. Shen, M. Ferrari y Y. Hu Enero de 2004 www.clinchem.org/content/60/1/233.full © Copyright 2014 by the American Association for Clinical Chemistry

Antecedentes Los biomarcadores circulantes actuales del cáncer de mama presentan una sensibilidad diagnóstica deficiente Sensibilidad de CA15-3 y CA27.29: 30 % en cada etapa; 60-70 % en casos avanzados; también mayor en enfermedades benignas El cribado mamográfico del cáncer de mama no se recomienda en las mujeres jóvenes (< 40 años) y no está adoptado comúnmente en las mujeres mayores La radiación es perjudicial para los pacientes positivos falsos en procedimientos de seguimiento Se necesitan con urgencia métodos nuevos y no invasivos para el diagnóstico temprano del cáncer de mama Consulte Editorial por Diamandis EP. Tumor Microenvironment–Released Peptides: Could They Form the Basis for an Early-Diagnosis Breast Cancer Test? (Péptidos tumorales liberados en el microentorno: ¿podrían servir de base para una prueba de diagnóstico temprano del cáncer de mama?) Clinical Chemistry 2014; 60: 4-6.

Antecedentes La actividad proteolítica en el microentorno del tumor (no necesariamente proveniente de células tumorales) puede liberar péptidos a la circulación que constituyen posibles biomarcadores para la supervisión de la evolución del tumor Proteasa/peptidasa Péptido circulante Microentorno del tumor Célula tumoral Complemento/cininógeno Célula inflamatoria Célula endotelial Fibroblasto Consulte Editorial por Diamandis EP. Tumor Microenvironment–Released Peptides: Could They Form the Basis for an Early-Diagnosis Breast Cancer Test? (Péptidos tumorales liberados en el microentorno: ¿podrían servir de base para una prueba de diagnóstico temprano del cáncer de mama?) Clinical Chemistry 2014; 60: 4-6.

Antecedentes La carboxipeptidasa N (CPN), también conocida como arginina/lisina carboxipeptidasa, forma parte de una familia más grande de metalopeptidasas de zinc La CPN realiza la escisión del extremo carboxílico (C) de la arginina o lisina de péptidos endógenos Sustratos: bradicinina (BK9), anafilotoxinas (C3a, C4a y C5a) y fibrinopéptidos A y B AEDT es un inhibidor de la CPN La relación entre el cáncer de mama, la CPN y las concentraciones circulantes de los productos proteolíticos de la CPN no se ha establecido Consulte Editorial por Diamandis EP. Tumor Microenvironment–Released Peptides: Could They Form the Basis for an Early-Diagnosis Breast Cancer Test? (Péptidos tumorales liberados en el microentorno: ¿podrían servir de base para una prueba de diagnóstico temprano del cáncer de mama?) Clinical Chemistry 2014; 60: 4-6.

Materiales y métodos Pacientes con cáncer de mama (BC): Modelo murino con cáncer de mama: (Ratones atímicos, n=8; estirpe celular de cáncer de mama: MDA-MD-231) Inyección 2 semanas 4 semanas 6 semanas 8 semanas Obtención de suero Obtención de tejidos Pacientes con cáncer de mama (BC): Control BC-I BC-II BC-III BC-IV Total Plasma sanguíneo 10 11 14 12 58 Porciones de tejidos 17 77 16 - 110

Materiales y métodos Fraccionamiento de nanoporos EM MALDI-TOF Análisis de datos Secuenciación de cuantificación Incubación Enjuage Elución proteínas grandes péptidos pequeños péptidos estándar Los péptidos circulantes se aislaron mediante micromatriz genética de sílice nanoporoso y se analizaron mediante espectrometría de masas

Resultados A B C Intensidad Factor I AEDT Quimotripsina AEDT Carboxipeptidasa N AEDT B C Figura 1. Análisis de escisión de péptidos ex vivo en el péptido C3f sintético. A. Análisis de escisión de péptidos C3f en NIF (líquido intersticial normal), CM (medio de cultivo celular acondicionado) y TIF (líquido intersticial tumoral). B. Los sitios específicos de escisión se indican en el péptido C3f, un sustrato del factor I de las enzimas, quimotripsina y CPN. C. Detección de expresión de CPN en diferentes condiciones de análisis. C3f, péptido sintético His6-C3f_S1304-R1320-His6 solamente; NIF o TIF, líquido intersticial normal o tumoral solamente; AEDT, un inhibidor de la CPN; NIF (CPN−) y TIF (CPN−), líquido intersticial de tejido normal y tumoral con reducción de CPN; CM (CPN−), medio acondicionado con reducción de CPN.

A Resultado Proteínas totales Densidad integrada Gel con coloración B C Normal (segunda semana) Normal (octava semana) Tumor (segunda semana) Tumor (octava semana) Semana Segunda semana Cuarta semana Sexta semana Octava semana Figura 2. Expresión de CPN en suero y tejidos de ratones. A. Expresión de inmunotransferencia de CPN en líquido intersticial mamario normal (NIF) y líquido intersticial tumoral (TIF). Se utilizó el gel con coloración azul brillante de Coomassie (CBB) para la evaluación de carga uniforme. Tanto la inmunotransferencia como el gel con coloración CBB estuvieron sujetos al análisis cuantitativo de la imagen mediante el software ImageJ (NIH) y el resultado se presentó por histograma. B. Análisis de inmunohistoquímica de CPN en tejido mamario normal y tejido tumoral obtenido en la 2da y la 8va semanas. C. Inmunotransferencia de CPN en suero de ratones. La seroalbúmina (SA) con coloración Ponceau S sirve como control interno de carga. (Grupos: 0, 2da, 4ta, 6ta, 8va semana; n = 4/grupo).

Resultado (3) RPPGFSPF (bradicinina) Intensidad relativa Período Figura 3. El diagrama de dispersión vertical de las intensidades de valores máximos normalizados en la EM MALDI TOF para las posibles características distintivas de péptidos en muestras de suero obtenidas de animales portadores de tumores (modelo murino con cáncer de mama). La relación de masa-carga y la identificación de secuencias se enumeran en cada panel. Número de ratones, n = 8; prueba de la t de Student, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

A Resultado (4) B C Control Sano Porcentaje Figura 4. Expresión de CPN en plasma y tejidos humanos. A. Tinciones de IHC para CPN en la cohorte de control humana (tejido próximo al cáncer o adenosis) y tejidos tumorales.. B. El histograma muestra el porcentaje de resultados de la puntuación de tinciones de IHC para CPN (n = 10, 7, 77 y 16 para control, preparaciones BC-I, BC-II y BC-III, respectivamente). El método de puntuación del patrón de tinción de IHC hace referencia al protocolo informado por Zhang y cols. (30). C. Expresión de CPN mediante inmunotransferencia en plasma humano de controles sanos y pacientes con cáncer de mama en diferentes etapas de la enfermedad (I, II, III y IV). La seroalbúmina (SA) con coloración Ponceau S sirvió como control interno. n = 4/grupo.

Resultado (5) m/z 904.48 RPPGFSPF (bradicinina) Intensidad relativa Controles Figura 5. Perfiles de posibles características distintivas de péptidos en plasma de mujeres sanas y mujeres con cáncer de mama en diferentes etapas patológicas. Número de muestra: n = 10, controles sanos; n = 11, etapa I del cáncer de mama (BC-I); n = 12, etapa II del cáncer de mama (BC-II); n = 15, etapa III del cáncer de mama (BC-III); n = 10, etapa IV del cáncer de mama (BC-IV); prueba de la t de Student, * P < 0.05, *** P < 0.001.

Análisis La expresión de CPN aumentó en el tejido mamario tumoral en comparación con el tejido mamario normal; sin embargo, no se observaron cambios en la concentración sanguínea Seis péptidos circulantes catalizados mediante CPN reflejan la mayor actividad de la CPN en tumores ya en la primera etapa patológica del cáncer de mama

Preguntas ¿Es posible usar un único biomarcador para el diagnóstico o pronóstico del cáncer? ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del uso de múltiples péptidos circulantes como biomarcadores del cáncer? ¿Por qué las concentraciones de péptidos catalizados mediante CPN seleccionadas no se correlacionaron de manera adecuada con la masa tumoral?

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