Introducción al estudio de las Proteínas

Introducción al estudio de las proteínas Mulder (1838): Describe un material presente en todos los seres vivos, con la siguiente composición porcentual en peso: C: 55 % H: 6.5 % O: 22 % N: 15 % S: 0.5 % Dado el contenido en azufre (0.5 %) el peso molecular mínimo de dicho material debería ser 32*100/0.5 = 6400

Las proteínas son susceptibles de hidrólisis ácida: HCl 6N, 90ºC, 18 horas En el hidrolizado aparecen aminoácidos, compuestos que contienen una función amino -NH2 y una función carboxilo, -COOH En las proteínas hay 20 aminoácidos distintos: los llamados aminoácidos proteicos Hay asimismo muchos otros aminoácidos que no forman parte de proteínas, los aminoácidos no proteicos Con frecuencia los aminoácidos proteicos aparecen modificados: son las modificaciones postraduccionales

Teoría del Enlace Peptídico

Teoría del Enlace Peptídico - Pruebas experimentales, 1 1. Las proteínas nativas tienen relativamente pocos grupos ácido-base titulables. A medida que progresa su hidrólisis, van apareciendo grupos -NH2 y -COOH en cantidad equimolar 2. En hidrolizados parciales se encuentran di- y tripéptidos cuya estructura puede determinarse directamente 3. Las enzimas que hidrolizan proteínas (tripsina, quimotripsina, pepsina, papaína) atacan al enlace -CO-NH-, tal como puede observarse en compuestos sintéticos (p.e. BAPNA) 4. Las proteínas dan positiva la reacción de biuret

Funciones biológicas de las proteínas - Biocatalizadores (enzimas) - Receptores de señales químicas - Transportadores - Estructurales (citoesqueleto, colágeno) - Defensa (inmune, restricción bacteriana, etc.) - Motilidad (motores moleculares) - Transducción - Adherencia celular y organización tisular - Plegamiento correcto de otras proteínas - Otras: anticongelante

Clasificación de las proteínas I. Según solubilidad (obsoleta): Albúminas, Globulinas, Prolaminas, Gliadinas, Escleroproteínas, etc. II. Según presencia o no de un grupo prostético: Proteínas simples y Proteínas conjugadas Holoproteína = Apoproteína + Grupo prostético III. Según presencia o no de subunidades: Proteínas monoméricas y proteínas oligoméricas IV. Según estructura global: Proteínas fibrosas y proteínas globulares

Aminoácidos

Aminoácidos Grupo carboxilo (disociado) Grupo amino (protonado) Carbono a Cadena lateral

Aminoácidos: estereoisomería L-Alanina L-Gliceraldehido

Aminoácidos: estereoisomería L-Alanina D-Alanina

L-Treonina L-Isoleucina

Aminoácidos alifáticos o neutros, 1 Glicina Gly, G NE Alanina Ala, A NE Valina Val, V E

Aminoácidos alifáticos o neutros, 2 Leucina Leu, L E Isoleucina Ile, I E

Aminoácidos alifáticos Su característica fundamental es la hidrofobicidad de la cadena lateral (con excepción de G) Suelen ocupar el interior de las proteínas globulares, donde contribuyen a la estructura global de la proteína debido al efecto hidrofóbico (“micela proteica”) Reactividad química muy escasa Glicina tiene un destacado papel estructural: suele ser invariante en series filogenéticas

Aminoácidos aromáticos Tirosina Tyr, Y NE Fenilalanina Phe, F E Triptófano Trp, W E Aminoácidos aromáticos

Aminoácidos aromáticos La presencia de sistemas aromáticos hace que absorban luz UV en torno a 280 nm; la absorción UV de las proteínas se debe a su contenido en estos aminoácidos F y W son hidrofóbicos

Serina Ser, S NE Treonina Thr, T E Hidroxiaminoácidos

Hidroxiaminoácidos El grupo -OH de la serina es fundamental en el centro activo de muchas enzimas (serin proteinasas, p.e.) Forma enlaces glicosídicos con oligosacáridos en ciertas glicoproteínas El grupo -OH tanto de S como de T es susceptible de fosforilación: importante modificación postraduccional que regula la actividad de muchas proteínas

Tioaminoácidos Cisteína Cys, C NE Metionina Met, M E

Tioaminoácidos Importante papel estructural de la cisteína por la posibilidad de formar enlaces disulfuro con otro residuo de cisteína La cisteína participa en el centro activo de muchas enzimas La metionina es el aminoácido iniciador de la síntesis de proteínas (codon AUG)

Aminas secundarias (“Iminoácidos”) Prolina Pro, P NE

Prolina Importante papel estructural: su presencia dificulta la formación de estructura secundaria Por esa misma razón suele ser invariante en series filogenéticas Como tal o modificado por hidroxilación (4-hidroxi- prolina) es muy abundante en el colágeno

Aminoácidos dicarboxílicos y amidas Ác.Aspártico Asp, P NE Asparragina Asn, N NE Ác.Glutámico Glu, E NE Glutamina Gln, Q NE

Aminoácidos dicarboxílicos y sus amidas Todos ellos son importantísimos intermediarios en el metabolismo nitrogenado, sobre todo E y Q Forman parte del centro activo de las glicosidasas y de las serin enzimas (tríada SHD) Proveen a la proteína de superficies aniónicas que sirven para fijar cationes (p.e., Ca++)

Aminoácidos dibásicos Lisina Lys, K E Arginina Arg, R E(?) Histidina His, H E Aminoácidos dibásicos

Aminoácidos dibásicos Lisina sirve para formar intermediarios covalentes en catálisis enzimática (bases de Schiff) Lisina es el aminoácido que une determinadas coenzimas a la estructura de la proteína Arginina es un importante intermediario en el ciclo de la urea Histidina forma parte del centro activo de muchas enzimas, debido al carácter nucleófilo del imidazol Histidina contribuye al tamponamiento de los medios biológicos por tener un pKa cercano al pH intracelular

Clasificación de aminoácidos según polaridad Aminoácidos apolares o hidrofóbicos: - A, V, L, I, F, W, M, P Aminoácidos polares sin carga eléctrica: - G, Y, S, T, C, N, Q Aminoácidos polares con carga eléctrica: - Aniónicos (-): D, E - Catiónicos (+): K, R, H

(dihidroxifenilalanina) Aminoácidos no proteicos: DOPA Catecolaminas Hormonas tiroideas Melanina L-DOPA (dihidroxifenilalanina)

w-Aminoácidos b-Alanina GABA g-Aminobutirato

Propiedades de las proteínas

Titulación ácido-base de una proteína Carga negativa neta pI Carga positiva neta

Grupos disociables de una proteína (Se indica el pKa de la cadena lateral en cada caso) Ácidos (aniónicos, - ) Asp 3.86 Cys 10.78 Glu 4.25 Tyr 10.07 Básicos (catiónicos, + ) Arg 12.48 His 6.00 Lys 10.53 Aniónicos: carga negativa neta por encima de su pKa Catiónicos: carga positiva neta por debajo de su pKa

Proteínas ácidas: punto isoeléctrico (pI) inferior a 7 Ricas en Asp y Glu; al pH celular presentan carga negativa neta. Proteínas básicas: punto isoeléctrico (pI) superior a 7 Ricas en Arg y Lys; al pH celular presentan carga positiva neta. En el medio biológico, son, por lo general, más abundantes las proteínas ácidas.

- + Electroforesis Muestra 1. Se realiza sobre un soporte sólido o semisólido, para mini- mizar efectos de difusión 2. Se somete el conjunto a un campo eléctrico constante, a un pH fijo; las proteínas migran conforme a su carga eléctrica - + 3. Terminada la carrera electro- forética, las proteínas se tiñen con un colorante adecuado (p.e., Azul de Coomassie)

Fundamento de la cromatografía Muestra: tres componentes mezclados Fundamento de la cromatografía Se dispone una mezcla sobre una fase estacionaria Fase estacionaria Se hace fluir una fase móvil sobre la estacionaria Dependiendo de la afinidad relativa por ambas fases, los componentes de la mezcla primitiva se separan Fase móvil

Tipos de cromatografía 1. Intercambio iónico - Separa según carga eléctrica - Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte insoluble - Fase móvil: gradiente de sal o de pH 2. Partición - Separa según solubilidad en solventes - Fase estacionaria: Un solvente sobre un soporte sólido - Fase móvil: El otro solvente fluyendo

3. Afinidad - Separa según la afinidad de la proteína por un ligando inmovilizado - Fase estacionaria: ligando unido a soporte insoluble - Fase móvil: (1) solución sin ligando (2) solución con ligando libre 4. Hidrofóbica - Separa según hidrofobicidad - Fase estacionaria: grupos hidrofóbicos unidos a un soporte insoluble - Fase móvil: gradiente inverso de sal 5. Exclusión molecular - Separa según tamaño molecular - Fase estacionaria: dextrano o agarosa entrecruzados - Fase móvil: solución tamponada

- - - Intercambio iónico - + + + Proteínas adsorbidas al intercambiador iónico A baja concentración de sal, se desprenden las proteínas menos electronegativas A mayor concentración de sal se desprenden las proteínas más electronegativas

Soportes cromatográficos

Cromatografía de intercambio iónico

Cromatografía de adsorción a colorantes

Cromatografía de afinidad

Solubilidad pI pH Punto isoeléctrico

Solubilidad Salting out Salting in Fuerza iónica, (M)

Solubilidad, g/L 100 100 Temperatura, ºC

Peso molecular de las proteínas 1. Métodos primitivos: presión osmótica, ultracentrifugación analítica, etc. 2. Cromatografía de exclusión molecular 3. Electroforesis SDS-PAGE 4. Cálculo directo a partir de estructura primaria

Cromatografía de exclusión molecular

Electroforesis en poliacrilamida-SDS (PAGE)

- - + +

Método de Kjeldahl Digestión ácida total de la proteína y conversión cuantitativa de nitrógeno a NH3, que se valora por titulación. Poco sensible. En desuso. Se sigue empleando para análisis elemental (p.e., alimentos) Proteína total= N x 100/16

Absorción a 280 nm Se fundamenta en la absorción a 280 nm producida por los aminoácidos aromáticos Phe, Tyr y Trp - Sensible y fácil de practicar - Requiere soluciones puras de proteína; no es aplicable a mezclas - Distintas proteínas dan diferente grado de absorción, dependiendo de su contenido en aa. aromáticos

Al tratar con Cu++ en medio alcalino, los compuestos con grupos -CO-NH- dan una coloración violeta. Muy específica; relativamente poco sensible Reacción del biuret

Método de Lowry Reacción en dos fases: 1. Reacción del biuret 2. Tratamiento con reactivo de fenoles de Folin-Ciocalteu - Muy sensible (muestras de 10 mg) y sencillo - Resultados variables con distintas proteínas, pues depende del contenido en aminoácidos aromáticos

Método de Bradford La fijación de un colorante (Azul de Coomassie) a una proteína modifica las características de absorción visible de aquél. Sensible, fácil de practicar y resultados muy constantes 400 500 600 0.2 0.3 0.4 700 Colorante Colorante + proteína l l