CROMATOGRAFÍA (parte I) Graciela Escandar

La elución en cromatografía en columna Resolución TEMAS A DESARROLLAR Conceptos generales Clasificación La elución en cromatografía en columna Resolución Sistemas cromatográficos (reparto, adsorción, intercambio iónico y exclusión molecular) Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) Cromatografía de gases

chroma = color graphé = escribir Origen A principios del siglo XX, el botánico ruso Tswett separó pigmentos vegetales pasando soluciones de estos pigmentos por una columna de vidrio empaquetada con CaCO3. Las especies separadas aparecían como bandas de colores, lo que dio origen al nombre del método chroma = color graphé = escribir

Un sistema cromatográfico consta de dos fases Fase móvil (líquida o gaseosa): contiene los componentes a separar y fluye a través de la fase estacionaria Fase estacionaria (líquida o sólida): a través de la cual fluye la fase móvil y donde quedan momentáneamente retenidos los componentes de la muestra

Definición Cromatografía: técnica separativa donde los componentes de una muestra se distribuyen entre dos fases (FM y FE), como consecuencia de su diferente afinidad hacia dichas fases. La separación se basa en las distintas velocidades de migración de los analitos, determinadas por el tiempo que permanecen en cada fase

Clasificación FM FE Método Interacción Líquida Gaseosa L-L y L-FL líquida sólida resina i.i. gel poroso otras partición L-L adsorción L-S Líquida (cromatografía líquida) intercambio iónico Inter. Iónico tamizado exclusión reacción específica afinidad Gaseosa (cromatografía gaseosa) G-L y G-FL partición G-L adsorción G-S Fluido supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos)

Clasificación De acuerdo a la disposición física de la FE Planar Columna papel capa delgada

Cromatografía en columna: elución Muestra FM FM FM FM Detector A + B B A B A B A B t0 t1 t2 t3 t4 Análisis cualitativo y cuantitativo

Objetivo de la cromatografía resolver los componentes de una muestra Cromatograma con picos no resueltos Mejora por aumento en la separación de bandas Mejora por disminución del ancho de bandas

Distribución de A y B dentro de la columna 1 t t 2 B A Concentración (CE) 3 t B A Distancia de migración (L) El ensanchamiento de cada banda se produce a una velocidad menor que su desplazamiento → se logran separaciones exitosas

Teorías del proceso cromatográfico La teoría del proceso cromatográfico debe explicar las variables que influyen en la velocidad de migración de los analitos y en el ensanchamiento de las bandas Teoría de los platos: concepto de N y H (similitud con columna de destilación fraccionada). Explica la forma gaussiana de las bandas pero no su ensanchamiento durante el proceso cromatográfico. Teoría cinética: La columna opera en situación de no-equilibrio. Nuevo concepto de N y H

Cromatograma t´ t SEÑAL DETECTOR t TIEMPO compuesto no retenido por FE analito

Isotermas de reparto y adsorción Cromatografía líquida Cromatografía de adsorción CM mda/mte CE CM masa adsorbida/masa adsorbente

Constantes termodinámicas K = CE CM Mide la distribución del analito entre FE y FM Constante de reparto Factor de retención (factor de capacidad) k = nE nM Describe la velocidad de migración del analito en la columna Mide la selectividad de la columna de un analito respecto a otro Factor de separación (factor de selectividad) a = kB kA

Relación entre las constantes termodinámicas y el tiempo de retención velocidad lineal del soluto v = L/tR velocidad lineal de la FM u = L/tM velocidad relativa del analito dentro de la columna L/tR v/u = tM/tR v/u = L/tM La velocidad relativa también se puede definir a partir de la fracción molar del soluto en la FM v/u = nM nM + nE = 1 1 + nE/nM = 1 + k 1

Relación entre las constantes termodinámicas y el tiempo de retención velocidad relativa = 1 + k 1 v/u v/u = tM/tR Igualando los segundos miembros de ambas expresiones tM tR 1 + k 1 = tR - tM tM k = tR = tM (1 + k) tR = tM (1 + K VE/VM)

Ancho de banda señal detector tiempo punto de inflexión t W= 4t

Parámetros relacionados con el ancho de banda Eficiencia N y H N = L/H N = 16 (tR/W)2

N = 16 (tR / W)2 H = s2 /L s L s t t tR L tR = Demostración = s t L tR H t L tR = 2 recordando que: W = 4t t = W/4 H W L 16 tR = 2 N L tR H W = 16 2 N = 16 (tR / W)2

Ecuaciones relacionadas con la eficiencia Relacionan la altura de plato teórico con los procesos dispersivos que ocurren dentro de la columna (A, B y C) y la velocidad de la fase móvil Ecuación de van Deemter H = A + B/m + Cm resistencia a la transferencia de masa difusión en remolino difusión longitudinal Otra ecuación H = A + B/m + CEm + CMm

A = 2  dp Difusión en remolino diámetro medio de partículas 3 3 2 2 1 1 A = 2  dp constante de empaque diámetro medio de partículas

Difusión longitudinal Dirección de FM factor de obstrucción B = 2  DM coeficiente difusión del analito en FM

Resistencia a la transferencia de masa Desde y hacia la FE: CE dirección de elución FM t1 FE FM t2 FE

Resistencia a la transferencia de masa 2 f D k) (1 qkd C + = FE líquida 2 d E k) (1 k 2t C + = FE sólida

Resistencia a la transferencia de masa Dentro de la FM: CM soporte M 2 c p D ) d , f(d C m =

Ecuación de van Deemter H = A + B/m + CEm + CMm m H CEm CMm H mínimo A B/m m óptimo

Resolución 2 D t r (W A + W B ) R = k B R = 1+ a-1 a 4 N

Optimización de la columna aumentar la separación entre bandas (DtR) disminuir el ancho de bandas Modificar variables termodinámicas (K, k y a) modificando FM, FE y temperatura Modificar variables que permiten ↓H y ↑N (ecuación tipo van Deemter)