"Año de la lucha contra la corrupción y la impunidad" UNIVERSIDAD NACIONAL JOSE FAUSTINO SANCHEZ CARRION FACULTAD DE CIENCIAS - E.P BIOLOGIA CON MENCION EN BIOTECNOLOGIA CURSO: Biotecnologia Vegetal TEMA: MICROPROPAGACIÓN DE Cattleya quadricolor DOCENTE: INTEGRANTES: Chinga Morales Cristel Pacheco Espinoza Diana CICLO: IX AÑO: 2019

MICROPROPAGACIÓN DE Cattleya quadricolor

La orquídea, gracias a sus flores exóticas, hace parte de una de las plantas de mayor demanda entre las ornamentales, y es además, la flor más representativa y conocida en el territorio Colombiano. Ha sufrido maltrato en su nicho ecológico e incluso se le ha confundido con otras especies del mismo genero por las condiciones anteriormente mencionadas entre otras, se le considera como una especie en vía de extinción (Herrera y col, 2007) Figura 1: Cattleya quadricolor

Estandarizar un protocolo para la micropropagación de Cattleya quadricolor, que permita a partir de semillas la obtención de plántulas, y de esta manera participar en la conservación de la biodiversidad de la flora Colombiana. OBJETIVO GENERAL

MATERIALES Y MÉTODOS ORIGEN DEL MATERIAL VEGETAL Se utilizaron cápsulas de la variedad Cattleya quadricolor de las cuales se extrajeron las semillas que posteriormente se sembraron bajo condiciones estériles. Figura 2: Cápsula de Cattleya quadricolor madura.

TRATAMIENTO DE LA CÁPSULA Desinfección de la cápsula La cápsula de Cattleya quadricolor en estado de madurez (antes de que se presente el fenómeno de la dehiscencia), fue lavada mediante inmersión en una solución de hipoclorito de sodio al 2%, durante 3 minutos con dos gotas de Tween 20 (Sigma®), posteriormente se realizaron dos enjuagues para eliminar el exceso de detergente con agua destilada estéril de acuerdo con la metodología propuesta por Lo et al, (2004). Apertura de la cápsula La cápsula se abrió longitudinalmente con la ayuda de un bisturí previamente desinfectado dentro de la cámara de flujo laminar (CABINA FLOW®), se extrajeron las semillas y se sembraron en los diferentes medios de cultivo distribuyéndolas homogéneamente con la ayuda de una asa de aro. Figura 3: Cápsula abierta de Cattleya quadricolor

MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA LA INDUCCIÓN DE LA GERMINACIÓN Y FORMACIÓN DE HOJA A PARTIR DE SEMILLA DE C. quadricolor Se evaluó el desarrollo germinativo de las semillas y la presencia de hojas a los 30 y 60 días respectivamente mediante la realización de los siguientes experimentos: Experimento 1: Efecto del medio Murashige Skoog (1962) completo y sin la presencia de reguladores de crecimiento. Se sembraron las semillas de C. quadricolor en el medio MS (1962) completo (Anexo 1), suplementado con sacarosa (30 g/L), phytagel (2 g/L), con un pH de 5.5 y sin la presencia de reguladores de crecimiento. Experimento 2: Efecto del medio Murashige Skoog (1962) a la mitad de la concentración final y sin la presencia de reguladores de crecimiento. Se sembraron las semillas en el medio Murashige Skoog (1962) a la mitad de su concentración final (MS/2), suplementado con sacarosa (30 g/L), phytagel (2 g/L), con un pH de 5.5 y sin la presencia de reguladores de crecimiento.

Experimento 3: Efecto del medio Murashige Skoog (1962) a la cuarta parte de la concentración final y sin la presencia de reguladores de crecimiento. Se sembraron las semillas en el medio Murashige Skoog (1962) con la cuarta parte de su concentración final (MS/4) suplementado con sacarosa (30 g/L), phytagel (2 g/L), con un pH de 5.5 y sin la presencia de reguladores de crecimiento. Una vez realizados los ensayos anteriormente mencionados, se procedió a evaluar en cada uno el porcentaje de semilla germinada a los 30 días y el promedio del tamaño de la hoja en cm a los 60 días

MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA LA INDUCCIÓN DE LA RIZOGÉNESIS A PARTIR DE PROTOCORMOS DE C. quadricolor Se evaluó el desarrollo radicular a los 90 días de los protocormos obtenidos a los 60 días mediante la realización de los siguientes experimentos: Experimento 4: Efecto del medio MS (1962) modificado suplementado con agua de coco y sin la presencia de reguladores de crecimiento. Se sembraron protocormos individualizados en el medio MS (1962) modificado (0.033 g/L de mioinositol) y suplementado con agua de coco en una concentración del 10% v/v (100 ml de agua de coco en 1 L de medio de cultivo), sacarosa (30 g/L), phytagel (2 g/L) a un pH de 5.5 y sin la presencia de reguladores de crecimiento. El agua de coco se obtuvo de cocos maduros de aproximadamente 1.2 kg comprados en el mercado local. El agua extraída fue refrigerada en una nevera convencional Philips Polarix®. Se almacenó durante 8 horas a 4 ºC, posteriormente se filtró utilizando una bomba de filtración BÛCHI® y se adicionó al medio de cultivo.

Experimento 5: Efecto del medio MS (1962) modificado suplementado con agua de coco y Ácido Naftalenacético (ANA). Se sembraron protocormos individualizados en el medio MS (1962) modificado (0.033 g/L de mioinositol) y suplementado con agua de coco en una concentración del 10% v/v (100 ml de agua de coco en 1 L de medio de cultivo), sacarosa (30 g/L), phytagel (2 g/L) a un pH de 5.5 y con la presencia de ANA en una concentración de 0.5 mg/L. Experimento 6: Efecto del medio MS (1962) modificado suplementado con jugo de piña y sin la presencia de reguladores de crecimiento. Se sembraron protocormos individualizados en el medio MS (1962) modificado (0.033 g/L de mioinositol) y suplementado con jugo de piña en una concentración del 10% v/v (100 ml de jugo de piña en 1 L de medio de cultivo), sacarosa (30 g/L), phytagel (2 g/L) a un pH de 5.5 y sin la presencia de reguladores de crecimiento. De una piña madura, se pesaron 300 g y se mezclaron con 0.5 L de agua destilada en una licuadora Oster® convencional. El jugo obtenido se filtró utilizando un tamiz de 0.5 µ con el propósito de retirar el bagazo y el líquido se adicionó al medio de cultivo.

Experimento 7: Efecto del medio MS (1962) modificado suplementado con jugo de piña y Ácido Naftalenacético (ANA). Se sembraron protocormos individualizados en el medio MS (1962) modificado (0.033 g/L de mioinositol) y suplementado con jugo de piña en una concentración del 10% v/v (100 ml de agua de coco en 1 L de medio de cultivo), sacarosa (30 g/L), phytagel (2 g/L) a un pH de 5.5 y con la presencia de ANA en una concentración de 0.5 mg/L. Una vez realizados los ensayos anteriormente mencionados, se procedió a evaluar en cada uno el promedio de la longitud de la raíz en cm a los 90 días.

RESULTADOS EVALUACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA LA INDUCCIÓN DE LA GERMINACIÓN Y FORMACIÓN DE HOJA A PARTIR DE SEMILLAS DE C. quadricolor Posteriormente, a los 30 días se observó la aparición de protocormos a partir de los cuales a los 45 días, se inició la aparición de los brotes foliares, proceso que se manifestó de una forma directa, es decir, sin observarse la formación de callo. A los 60 días ya se tenían hojas emergentes de un rizoma grueso y los protocormos totalmente desarrollados fueron trasplantados a otros medios para inducir el enraizamiento. En este tratamiento se observó un porcentaje de germinación de la semilla del 88% a los 30 días y un promedio de longitud de la hoja de cm a los 60 días Figura 4: (A). Semillas de C. quadricolor antes de ser sembradas en los diferentes medios de cultivo en los que se llevó a cabo la germinación. (B). Semillas de C. quadricolor germinadas luego de 15 días de realizada la siembra en el medio MS completo sin la presencia de reguladores de crecimiento.

Figura 5: Semillas de C. quadricolor germinadas a los 30 días en el medio MS completo sin la presencia de reguladores de crecimiento (Tratamiento 1). Se observan los cuerpos protocórmicos que posteriormente se llevaron a enraizamiento. Figura 6: Protocormos de C. quadricolor desarrollados en el medio MS completo sin la presencia de reguladores de crecimiento (Tratamiento 1) a los 60 días después de realizada la siembra.

El tratamiento 2 (MS/2) mostró un comportamiento similar al tratamiento 1, sin embargo en el tratamiento 2, el engrosamiento de las semillas y la coloración verdosa se manifestó en una menor proporción, lo cual esta íntimamente relacionado con la disminución de la germinación, observando a los 30 días una germinación equivalente al 64%, y un promedio de longitud de la hoja a los 60 días de cm, valores inferiores a lo encontrado en el tratamiento 1. Figura 7: Semillas de C. quadricolor después de 30 días de realizada la siembra en el medio MS/2 y sin la presencia de reguladores de crecimiento El tratamiento 3 (MS/4) se observó un porcentaje de germinación a los 30 días 54% y un promedio de longitud de la hoja cm a los 60 días mucho menor comparado con los tratamientos 1 y 2,, lo cual esta directamente relacionado con la presencia de callo en este tratamiento.

EVALUACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA LA INDUCCIÓN RADICULAR A PARTIR DE PROTOCORMOS DE C. quadricolor Los protocormos obtenidos en el tratamiento 1 el cual se consideró como el mejor, fueron transferidos a los tratamientos 4, 5, 6 y 7 con el propósito de inducir el enraizamiento, utilizando el medio MS (1962) suplementado con agua de coco, 36 jugo de piña y ANA como regulador de crecimiento evaluando el promedio de la longitud de la raíz a los 90 días. En el tratamiento 4 (Medio MS + Agua de coco) los protocormos se adaptaron fácilmente al nuevo medio; el rizoma comenzó a desarrollar raíces a los de 15 días de realizado el transplante. Después de 60 días de realizada la siembra, las raíces presentaron un desarrollo completo, buena longitud y espesor; las hojas del protocormo en el momento de realizar el transplante se prolongaron aún más y se logró distinguir y diferenciar la presencia de una vitroplanta completa a los 90 días contados a partir de la siembra de la semilla. En este tratamiento se observó un promedio de longitud de la raíz a los 90 días de cm. Figuras 8: Presencia de raíces a los 15 días después del transplante de protocormos de C. quadricolor al medio MS modificado suplementado con agua de coco y sin reguladores de crecimiento.

Figuras 9: Vitroplanta de C. quadricolor formada en el medio MS modificado suplementado con agua de coco y sin reguladores de crecimiento (Tratamiento 4) a los 90 días de realizada la siembra de la semillas. Figura 10. Proceso in vitro de la C. quadricolor desde la germinación de la semilla hasta la obtención de la planta completa a los 90 días de realizada la siembra de las semillas.

GRACIAS