DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA

Presentación del tema: "DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA"— Transcripción de la presentación:

1 DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA EVALUACIÓN DEL EFECTO DE ÁCIDO GIBERÉLICO CON AGUA DE COCO Y CASEÍNA HIDROLIZADA COMO FUENTES DE NITRÓGENO EN LA MADURACIÓN DE EMBRIONES DE PALMA COCO CUMBÉ (Parajubaea cocoides Burret) OBTENIDOS A PARTIR DE CALLOS, MEDIANTE ESTABLECIMIENTO DE SUSPENSIONES CELULARES. BLANCA ESTHELA ENCALADA ALDAZ Ing. Cristian Javier Peña Pontón Director M.Sc. Grace Tatiana Páez Barrera Codirectora Dr. Marcelo Mejía Secretario Académico

2 Parajubaea cocoides Burret
INTRODUCCIÓN Arecaceae Suramérica  Colombia  hasta Ecuador Palma alto andina Valles y alturas ecuatoriales 15-20 m. de altura Parajubaea cocoides Burret  Endocarpio Parajubaea cocoides Burret, es una especie que pertenece a la familia Arecaceae, es originaria de Suramérica desde Colombia hasta Ecuador, es una palma ornamental que se encuentra generalmente en avenidas y parques. Su atractivo paisajístico es emblemático ya que realza la belleza arquitectónica de las edificaciones de la cuidad, por tanto es considerada como una especie decorativa en Ecuador (Acosta, 1971). Se propaga y comercializa en viveros privados y municipales en Quito y sus alrededores. Es una planta ornamental apreciada en las ciudades de la región andina, se considera una planta cara en comparación con otras especies ornamentales. Los comerciantes establecen su precio de acuerdo al tiempo que demora en germinar y crecer (Anexo E) (Balslev et al., 2013). En nuestro país, esta especie no registra estudios y datos poblacionales en estado silvestre, y tampoco se tiene evidencia que la especie esté en peligro de extinción en áreas naturales, sin embargo esta palma posee un valor cultural, ornamental y alimenticio, dentro de las zonas pobladas y urbanas, por ende se debería contribuir a su preservación. (Balslev et al., 2013). Las seis especies endémicas son reportadas únicamente en Ecuador. De las 111 especies nativas, seis especies solo se reportan en Ecuador y Colombia (Parajubaea cocoides Burret, Dasyphyllum popayanense. Es de suma importancia averiguar más sobre su propagación, pues es una especie que no ha sido plantada durante varias décadas, y los individuos remanentes son adultos de muchos años de edad.

3 Palma solitaria monoica
Espermatofita Angiosperma Dicotiledóna Tallo liso Hojas pinadas Palma solitaria monoica Es una planta que pertenece a las palmas solitarias monoicas, llega a medir aproximadamente 20 metros de altura, posee un tallo solitario de 6-16 metros de color pardo oscuro y liso, constituida por 30 hojas arqueadas con foliolos dispuestos verticalmente. Produce varias inflorescencias e infrutescencias entre las hojas (figura 1.2a). Flores unisexuales con estambres organizadas en triadas, dos laterales masculinas de color morado ubicadas en la parte distal y una central femenina de color amarrillo dorado ubicada en la parte proximal de la inflorescencia. Posee alrededor de frutos elipsoides (4.5-5 x cm) de coloración verde negruzcos al madurar (figura 1.2b) (Moraes & Henderson, 1990; Balslev et al., 2013; Acosta, 1971). Es una palma de fácil identificación, aunque es parecida a un cocotero (Cocos nucifera), la diferencia radica en que esta palma crece en tierras bajas de la Costa y en la Amazonia. En Ecuador se ha observado que la palma coco cumbé permanece con flores y frutos todo el año, sus principales polinizadores son las abejas europeas africanizadas (Balslev et al., 2013). Frutos elipsoides Infrutescencias Inflorescencia

4 Distrito Metropolitano de Quito emprende proyectos para la reforestación de esta especie.
Especie amenazada El Municipio de Quito, ha identificado 24 especies emblemáticas de la cuidad, lamentablemente, Parajubaea cocoides Burret, no está incluida dentro de este grupo. Esta palma es un icono de la región andina, ya que posee valor cultural y alimenticio, por ende debería formar parte de esta lista, contribuyendo de esta manera a su preservación. Se encuentra amenazada debido a diversas causas, tales como: tala indiscriminada, vandalismo, incendios forestales, crecimiento poblacional urbano y vial, transformaciones agrarias, plagas y agentes atmosféricos (Henderson &Bernal, 1995). Sin embargo no se tiene certeza si la especie está en peligro de extinción dentro de la naturaleza ecuatoriana, pues hasta el momento por los botánicos, no ha sido registrada en estado silvestre en nuestro país (Balslev et al., 2013). Parajubaea cocoides Burret, es una palma alto andina de los valles y alturas ecuatoriales desde Loja hasta Ibarra, puede llegar a alcanzar veinte metros de altura; son palmeras decorativas e interesantes por su resistencia al frio, ya que se ha constatado que pueden superar temperaturas mínimas de cuatro a cinco grados bajo cero, también favorecen la captación de CO2, control de erosión y actúan como regulador climático, por tanto sería conveniente que se cultiven en mayor cantidad (Pintaud &Aleano, 2008). Una de las razones principales para que no se cultive la palma, es debido a que la germinación puede tardar de seis a ocho meses, y puede incluso no darse este proceso ya que el endospermo de esta especie es muy sensible al ataque de micro-organismos y a la humedad. Esta palma tiene raíces muy sensibles a la manipulación, rasguños, desgarros, rupturas, cambio de temperatura, humedad y en general al cambio de pH, dificultando su trasplante y por ende su desarrollo vegetativo y adaptación al campo; por estas razones se sugiere como una opción para la producción de Parajubaea cocoides Burret, la aplicación de técnicas de cultivo in vitro (Pintaud &Aleano, 2008). Seis y ocho meses Endospermo sensible Raíces sensibles

5 ETAPAS Fases de los embriones
-Inducción -Proliferación -Diferenciación -Maduración -Germinación Embriogénesis somática Fusión de gametos v Embriogénesis Somática Directa Tipos de embriogénesis Embriogénesis Somática Indirecta Eje apical Fases de los embriones Eje radicular La embriogénesis somática in vitro, es posible ya que los tejidos somáticos vegetales tienen la capacidad de desarrollarse en un embrión, por medio de la manipulación de las condiciones de cultivo y la aplicación de reguladores del crecimiento (Reinert, 1958; Steward, Mapes &Mears, 1958). La embriogénesis somática, es la formación de un embrión a partir de una célula, sin la necesidad de la fusión de gametos, por ello, los embriones somáticos son estructuras bipolares, con un eje radical y apical, y no poseen conexión vascular con el tejido materno. No contienen un nuevo grupo de genes, sino que poseen la misma combinación genética de la planta madre de la cual se toma el explante (Pérez, 1998; Roca, 1993). En dicotiledóneas, el desarrollo de un embrión somático, presenta características morfológicas semejantes a las de un embrión cigótico. Ambos se caracterizan por la diferenciación de una estructura bipolar, ya que los dos pasan por los estadíos de desarrollo proembrionario y embrionario, como se puede observar en la figura 1.3 (Guerra, 1999). La diferencia principal entre embriones cigóticos y somáticos, son sus sistemas de iniciación; es decir los embriones cigóticos se forman a partir de la unión de los gametos, la doble fecundación y finalmente las plantas que se originan son híbridas por la recombinación meiótica de sus genes. Por el contrario, los embriones somáticos se originan de células vegetativas de un único individuo, y las plantas resultantes son duplicados genéticos o clones de la planta madre (Guerra, 1999). Teóricamente esta técnica, es la más eficiente para la producción masiva de plantas in vitro ya que el embrión posee una naturaleza bipolar, sus altos coeficientes de multiplicación en cortos períodos de tiempo y finalmente la posibilidad de encapsular estas estructuras formadas y obtener semillas artificiales. Sus desventajas radican en el desconocimiento que existe sobre los parámetros que regulan este proceso (Yeung et al., 1996). Embriogénesis Somática Directa: se obtienen embriones somáticos directamente desde células aisladas o grupos de células sin la formación de callo (figura 1.5). Este hecho se puede describir, como una formación accidental del embrión; este tipo de embriogénesis, ofrece varias aplicaciones como: clonado directo de híbridos comerciales F1; clonado rápido de un material de apreciado valor para el mejoramiento; selección in vitro, y mejoramiento de genotipos para diferentes caracteres de plantas completas en el estado más temprano del ciclo de su vida (Girón, 1998; Pérez, 1998). Embriogénesis somática Indirecta: implica la necesidad de una inducción para que las células sigan la vía embriogénica, tras pasar por una fase proliferativa (callo) y cambiar su competencia a la expresión de embriogénesis (figura 1.6).  Se utilizan dos medios de cultivo: el primero, de inducción, para la callogénesis y un segundo medio, de regeneración, para producir callos friables. Se producen cientos de miles de embriones somáticos por gramo de callo; los embriones somáticos completamente diferenciados pueden pasarse a un medio de regeneración, donde se desarrollan las raíces y los tallos, hasta la formación de plántulas de 4 a 5 pares de hojas aptas para ser transferidas a condiciones in vivo (Barreto, 2003; Berthouly, 1989). Uno de los eventos iniciales para la inducción de la embriogénesis somática es la terminación de la salida del gen o los genes del patrón de expresión lo que permite su reemplazamiento con el programa de la embriogénesis. Un posible mecanismo para regular la baja expresión de los genes es la metilación del ADN, la cual ha sido correlacionada con la cantidad de auxina exógena presente en el medio de cultivo; por lo cual tratamientos de estrés que permitan mantener baja la regulación de la expresión de los genes del tejido del explante, pueden también estimular la embriogénesis somática. Se han empleado diferentes técnicas tales como: estrés con calor, anaerobiosis, temperaturas bajas (4.0°C) y también la exposición a la auxina (Merkle et al., 1995). Existen dos tipos de embriogénesis somática indirecta, una conocida como embriogénesis somática de baja frecuencia, en donde el número de callos con embriones somáticos es mayor, aunque se forman pocos embriones somáticos por callo; estos embriones aparecen entre las semanas de cultivo, en pequeños grupos o aislados, que se desarrollan completamente pasando por los diferentes estadios, mientras que en la embriogénesis somática de alta frecuencia, los embriones aparecen entre las semanas de cultivo, no se desarrollan completamente y se mantienen en estado globular (Berthouly, 1989). Inducción: en esta fase la célula aislada por continuas divisiones, forma agregados celulares embriogénicos, con la presencia de una auxina en el medio de cultivo; esta etapa representa la transición de células somáticas (2n cromosomas) en células embriogénicas capaces de producir embriones somáticos. Es la fase más importante del proceso, a la vez más difícil y menos conocida (Von, 2002). Es importante mencionar que entre más joven sea el tejido utilizado, más fácil será desviarlo de su programa genético, para así obtener la desdiferenciación hacia la formación de embriogénesis somática. Esta etapa se realiza en oscuridad porque la luz es un factor de diferenciación que se opone a la formación de células juveniles. Sin embargo, la respuesta embriogénica del callo depende también del genotipo de la planta (Roca, 1993), y por eso se presenta una de las mayores dificultades para establecer un proceso de embriogénesis somática, aplicable a todos los genotipos, y que sea reproducible (Girón, 1998; Pérez, 1998). Es usualmente fácil, distinguir entre callo embriogénico y no embriogénico, basado en su morfología y color, el callo embriogénico es de color blanco amarillento, compacto, con estructuras nodulares y crecimiento lento; mientras que el no embriogénico es de color amarillo- café, traslúcido, húmedo, rugoso, cristalino y de apariencia no organizada (Hussein, 2006; Von, 2002). Proliferación del callo: uno de los más poderosos aspectos de la embriogénesis somática que permite su aplicación en la propagación masiva y la transferencia de genes, es la habilidad de los cultivos embriogénicos de muchas especies de plantas a proliferar o multiplicarse indefinidamente. El factor más fuerte asociado con la continua proliferación de las células embriogénicas es la auxina. Sin embargo, parece ser que el efecto de esta fitohormona, no puede ser considerado independiente a la reducción de la concentración de nitrógeno, existiendo una fuerte evidencia de la interacción entre ambos (Pérez, 1998). Diferenciación y desarrollo de embriones somáticos: en esta etapa, las masas de células proembriogénicas, se diferencian y forman embriones somáticos, mediante una división y diferenciación celular. Estos embriones inicialmente se manifiestan en estado globular, luego en estado corazón y finalmente en estado torpedo. En la mayoría de las plantas esta fase es estimulada por una disminución de la concentración de auxina en el medio (Barreto, 2003). Halperin y Welherell (1965), caracterizaron el “choque auxínico”, como el estímulo decisivo de la embriogénesis somática (Girón, 1998). Uno de los eventos más importantes que ocurre durante el desarrollo de los embriones, es la diferenciación de meristemos radicales y apicales (Hussein, 2006). Maduración y germinación: La etapa de maduración es un período de transición entre las fases de desarrollo y de germinación del embrión, para lo cual participan un grupo de genes distintos. Durante esta fase, se da la acumulación de reservas de proteínas, glúcidos, lípidos y se realiza la desecación (Parrot, 1993); además de ocurrir el proceso de alargamiento celular sin división (Pérez, 1998).Durante la maduración los embriones somáticos se someten a varios cambios morfológicos y bioquímicos (Parrot, 1993). Por otra parte, los niveles elevados de nutrientes obtenidos a través de diferentes factores como: volumen del medio, frecuente transferencia de los embriones a cultivos nuevos, etc., han incrementado el tamaño, el contenido total de proteínas de los embriones, y han mejorado la conversión de éstos a plantas (Girón, 1998). Seguidamente, el proceso de alargamiento continúa y se produce una reactivación metabólica del embrión somático maduro, para convertirse en una plántula. Para que esto suceda, se requiere estímulos de luz y la presencia de ácido giberélico o citocininas (Barreto, 2003). Por lo que si embriones jóvenes, no son transferidos a un medio con baja concentración o sin presencia de auxinas, después de la inducción de embriogénesis, éstos no madurarán adecuadamente y generarán embriogénesis secundaria (Manzanilla, 2004). En términos de nutrición, es fundamental tener en cuenta los suplementos del medio de cultivo como las auxinas, los carbohidratos, el nitrógeno y el ácido abcísico (Frenando &Gamage, 2000). McKersie y Bowley (1996), encontraron que la adición de prolina como suplemento del medio de cultivo, favorece el número de embriones en estados avanzados y el tamaño de los embriones; por otro lado, la presencia de nitrógeno en el medio de cultivo se garantiza con la adición de nitratos, amonios, aminoácidos y caseína hidrolizada. Perera, Vidhanaarachchi, Gunathilake, Yakandawala, Hocher, Verdeil & Weerakoon (2009), utilizaron BAP (5 µM), en conjunto con 2ip (5 µM), en el medio de cultivo durante esta etapa, logrando aproximadamente un 85% de conversión de embriones de coco. Estos autores mostraron, además, que la inclusión de ácido giberélico (0,45 µM) al medio de cultivo, fomentó considerablemente la maduración de embriones. Según Nolan &Ho (1988), la presencia de GA3 en el medio aparentemente induce la expresión temprana de genes involucrados en el proceso de germinación. El GA3 aumenta cinco veces la frecuencia de maduración y regeneración de plantas a partir de los callos completos. Sin embargo, la presencia de esta hormona no tendrá efecto en el porcentaje de germinación de embriones somáticos aislados. La adición de hidrolizado de caseína en el medio MS, permite duplicar el número de plantas regeneradas. El digesto de caseína probablemente completa los requerimientos en aminoácidos para la síntesis de proteínas y el metabolismo hormonal, normalmente provisto por el endosperma como ocurre en la germinación de los embriones (Frenando &Gamage, 2000). En la figura 1.7 se detalla las etapas de embriogénesis somática en zanahoria. Torpedo Globular Corazón Cotiledonar

6 OBJETIVOS GENERAL Evaluar el efecto de ácido giberélico, agua de coco y caseína hidrolizada en la maduración de embriones somáticos de palma coco cumbé (Parajubaea cocoides Burret) obtenidos a partir de callos, mediante establecimiento de suspensiones celulares. ESPECÍFICOS Validar el método de desinfección, establecimiento e inducción de callo embriogénico de palma coco cumbé. Evaluar el efecto y la concentración adecuada de ácido giberélico en la maduración de los embriones somáticos. Evaluar el efecto del agua de coco y caseína hidrolizada como fuente de nitrógeno orgánico.

7 METODOLOGÍA Concentración (cell/ml) = Número de células * / Número de cuadros M &S(1962) 0.1 mg L-1 AIA, 0.8 mg L-1 BAP, 2.5 mg L-1 sulfato de adenina, 40 g L-1 sacarosa, 200 mgL-1 CH, agua de coco y ácido giberelico M&S (1962) 1 mg L-1 Tiamina ,60 mg L-1 2,4 D, 1 g L-1 carbón activado, 30 g L-1 de azúcar y 7 g L-1 de agar Solución de detergente por 10 minutos. (NaClO) al 2.5 % por 10 minutos Fase de desinfección Fase de inducción de callo embriogénico Fase de conteo celular Fase de establecimiento de las suspensiones celulares

8 Tratamientos de la maduración
M& S(1962) a la mitad de su concentración 0.1 mg L-1 ácido indol acético 0.8 mg L-1 de benzilaminupurina 2.5 mg L-1 sulfato de adenina 40 g L-1 de sacarosa Fase de maduración de embriones somáticos Fase de identificación embrionaria Tratamientos GA3 (mg L-1) Fuente de nitrógeno M1 1.5 Agua de coco (35 ml) M2 3 M3 Caseína hidrolizada (200 mg L-1) M4 Control - Tratamientos de la maduración Fuente: (Muñoz, 2003; Jha et al., 2007; Sujatha et al., 2008).

9 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Fase de desinfección 90 embriones sembrados Contaminación del 1,11% Sobrevivencia del 98,89% En la validación de la desinfección se procedió a sembrar 15 embriones, tomando en cuenta que se repitió el procedimiento seis veces, es decir en total obtuve 90 embriones sembrados, de los cuales solo uno se contaminó. Logrando un porcentaje de contaminación del 1,1%, por lo tanto la sobrevivencia de los embriones fue de 98,89% (A) Embriones sembrados después de la desinfección, (B) Explante sin contaminación, (C) Explante contaminado

10 Fase de inducción de callo embriogénico
Se observó viabilidad, pues permitió la formación de un fragmento de callo friable (coloración blanquecina amarillenta) (figura 3.2 b) en los 90 callos que fueron sembrados, validando y obteniendo resultados similares con el protocolo establecido por Sanchéz (2013). (A) Callos sembrados, (B) Porción de callo friable

11 Cinética celular Al realizar el recuento celular con la cámara de Neubauer, se observó las diferentes etapas identificadas en la curva representativa de la cinética de celular de Parajubaea cocoides Burret, donde apreciamos con claridad el proceso de evolución de la biomasa en la suspensión celular. Como se mencionó anteriormente, existen cinco fases de crecimiento celular, las cuales se muestran en la figura 1.6 y son: fase de retraso, fase exponencial, fase lineal, fase de desaceleración progresiva y fase estacionaria. A continuación se muestra estas etapas observadas con la ayuda de la cámara de Neubauer (figura 3.4). Con los datos obtenidos del conteo celular, se logró obtener la curva de la cinética celular de las cuatro suspensiones, en las figuras 3.5, 3.7, 3.9 y 3.11, se representa gráficamente la cinética celular para cada una de las suspensiones. Conteo celular en Parajubaea cocoides Burret (A) fase de retraso, (B) fase exponencial, (C) fase logarítmica, (D) fase estacionaria.

12 Fase de establecimiento de las suspensiones celulares
16 días C1: 1.5 mg L-1 de GA3 y 35 ml de AC C2: 3 mg L-1 de GA3 y 35 ml de AC 22 días C3: 1.5 mg L-1 de GA3 y 200 mg L-1 de caseína hidrolizada Una vez transferido el callo a medio líquido se buscó el establecimiento de las suspensiones celulares, donde las células se adaptan a las nuevas condiciones, es decir a un medio líquido y agitación constante. Durante el tiempo de adaptación de las células, y cada 17 días se hizo la reposición de medio en las suspensiones uno y dos, mientras que cada 22 días se hizo la reposición del medio en las suspensiones tres y cuatro, obteniendo como resultado una suspensión de color blanquecino y translúcido, como podemos observar en la figura 3.3 gráfico c, en estos tiempos las células llegaron a su fase estacionaria agotando todos los nutrientes del medio. (a) Eliminación del medio de cultivo, (b) Reposición del medio en la suspensión, (c) suspensión de color translucida C4: 3 mg L-1 de GA3 y 200 mg L-1 de caseína hidrolizada

13 Suspensión uno Día 16 Curva de la cinética celular
Ajuste del crecimiento celular Como apreciamos en la figura 3.5, la curva cinética de la suspensión celular uno muestra un retraso en su etapa inicial hasta el día cuatro, con un aumento mínimo de la población, posteriormente se observa un aumento celular considerable hasta el día 16, luego el crecimiento es menor hasta el día 22, y a partir del día 25 se nota que empieza a bajar su densidad. Fruto del análisis de regresión, con ayuda del programa CurveExpert 2.4.0, se obtiene la ecuación interpolante de la suspensión, la cual es de tercer grado con un coeficiente de correlación de y su representación gráfica se muestra en la figura 3.6. En la Wikipedia podemos encontrar esta buena explicación de lo que es la correlación: “La correlación es la medida de asociación entre variables. En probabilidad y estadística, la correlación indica la fuerza y la dirección de una relación lineal entre dos variables aleatorias. Se considera que dos variables cuantitativas están correlacionadas cuando los valores de una de ellas varían sistemáticamente con respecto a los valores homónimos de la otra: si tenemos dos variables (A y B) existe correlación si al aumentar los valores de A lo hacen también los de B y viceversa.” El coeficiente de correlación sirve para medir la correlación entre 2 variables. La ventaja que tiene este coeficiente sobre otras herramientas para medir la correlación, como puede ser la covarianza, es que los resultados del coeficiente de correlación están acotados entre -1 y +1. Esta característica nos permite comparar diferentes correlaciones de una manera más estandarizada. Como he mencionado antes, el coeficiente de correlación tiene un valor acotado entre -1 y +1. Los valores cercanos a cero indican que no hay asociación entre las variables. Valores cercanos a uno indican una asociación fuerte, mientras que los valores cercanos a menos uno indican una asociación fuerte pero inversa.

14 Suspensión dos Día 16 Ajuste del crecimiento celular
En la figura 3.7, que representa la suspensión dos, se observa que hay un aumento del número de células desde el primer día con una curva creciente moderada hasta el día 5, luego hay un incremento acelerado de células hasta el día 16. A partir del día 17 hasta el 25, empieza a desacelerarse el incremento del número de células y para el día 28 se observa una disminución notoria en la densidad celular. El análisis de regresión realizado con el programa CurveExpert 2.4.0, genera una ecuación interpolante de la suspensión dos de tercer grado con un coeficiente de correlación de 0.992, y su representación gráfica se muestra en la figura 3.8. Curva de la cinética celular Ajuste del crecimiento celular

15 Suspensión tres Día 22 Ajuste del crecimiento celular
En la figura 3.9, que representa la suspensión tres, se observa que hay un aumento del número de células con una curva creciente moderada hasta el día 8, luego hay un incremento acelerado de células hasta el día 19. A partir del día 22 hasta el 25, empieza a desacelerarse el incremento del número de células y para el día 28, se observa una disminución en la densidad celular. El análisis de regresión nos permitió obtener una ecuación interpolante de la suspensión tres, la cual es de tercer grado con un coeficiente de correlación de 0.996, y su representación gráfica se muestra en la figura 3.10. Curva de la cinética celular

16 Suspensión cuatro Día 22 Ajuste del crecimiento celular
Finalmente en la figura 3.11, la curva cinética de la suspensión celular cuatro muestra un crecimiento en la etapa inicial hasta el día 5, posteriormente se observa un aumento celular considerable hasta el día 22, luego el crecimiento decrece hasta el día 25 y a partir del día 28, se nota que empieza a bajar su densidad. El análisis de regresión nos permitió obtener una ecuación interpolante de la suspensión cuatro de tercer grado con un coeficiente de correlación de 0.997, y su representación gráfica se muestra en la figura 3.12. Por lo tanto, según lo observado en las figuras 3.5 y 3.7, que corresponden a las suspensiones uno y dos, se puede establecer que a los 17 días, comienza el decrecimiento celular y por ende se realizó el cambio de medio, mientras que para las suspensiones tres y cuatro se realizó el cambio de medio a los 22 días, como se puede observar en las figuras 3. 9 y 3.11 respectivamente. Se uso la interpolación para disminuir el grado de error, ocasionado por la temperatura, medio de cultivo, rapidez de adaptación de las células. Se logró disminuir cierto grado de error, y con la aplicación de la interpolación a partir de valores previos es posible que ésta vaya determinando su comportamiento variable, logrando obtener una función más acorde a la realidad, y con un métmétodo que nos permite determinar la cantidad de células y el tiempo en que se obtendrán. Por lo tanto, según lo observado en las figuras 3.4 y 3.6, que corresponden a la suspensión uno (1.5 mg L-1 de ácido giberélico y 35 ml de agua de coco), y a la suspensión dos (3 mg L-1 de ácido giberélico y 35 ml de agua de coco), se puede establecer que a los 16 días, comienza el decrecimiento celular y por ende se realizó el cambio de medio, mientras que para la suspensión tres (1.5 mg L-1 de ácido giberélico y 200 mg L-1 de caseína hidrolizada), y la suspensión cuatro (3 mg L-1 de ácido giberélico y 200 mg L-1 de caseína hidrolizada), se realizó el cambio de medio a los 22 días, como se puede observar en las figuras 3. 8 y 3.10 respectivamente. Ajuste del crecimiento celular Curva de la cinética celular

17 Análisis de varianza paramétrica y prueba de LSD Fisher
Mejor suspension Formación de células Mediante un análisis de varianza paramétrica, para el efecto de la mejor suspensión en relación a la cantidad de células, se encontró un valor (p< 0,001%), menor al nivel de significación nominal de la prueba (α=5%), por lo que se sugiere el rechazo de la hipótesis de igualdad de las medias de los tratamientos. Con respecto a la prueba de LSD Fisher, se encontró tres grupos estadísticos, donde se observa que la concentración de 1.5 mg L-1 de ácido giberélico con agua de coco pertenece al grupo A, y las concentración de 3 mg L-1 de ácido giberélico con agua de coco están en el grupo B, mientras que las concentraciones de 1.5 y 3 mg L-1 de ácido giberélico con caseína hidrolizada pertenecen al grupo C, por lo tanto se evidencia que las suspensiones tres y cuatro, presenta la media más alta con respecto a la formación de células en relación al tiempo (tabla 3.1). Análisis de varianza paramétrica y prueba de LSD Fisher

18 Fase de maduración de embriones somáticos
Sin fuentes Nitrógeno GA3 Necrosan Se debe especificar y mencionar que los embriones colocados en el tratamiento testigo, sin fuentes de nitrógeno y ácido giberelico se necrosaron y finalmente murieron (A) embriones necrosados en el tratamiento testigo, (B) embriones en desarrollo Mueren

19 Prueba de Kruskal-Wallis
Embrión globular Prueba de Kruskal-Wallis De acuerdo al análisis de varianza no paramétrica para el efecto de la concentración del ácido giberélico, se encontró un valor (p< 0,001%), menor al nivel de significación nominal de la prueba (α=5%), por lo que se sugiere el rechazo de la hipótesis de igualdad de las medias de tratamientos.4 Con respecto a la prueba de Kruskal-Wallis (tabla 3.3), se encontró dos grupos estadísticos, donde se observa que las concentraciones de 1.5 y 3 mg L-1 de ácido giberélico con caseína hidrolizada pertenecen al grupo A, y las concentraciones de 1.5 y 3 mg L-1 con agua de coco están en el grupo B, por lo tanto se evidencia que el tratamiento uno, presenta la media más alta con respecto a la formación de embriones en fase globular. El análisis de varianza propuesto por Kruskal y Wallis permite comparar las esperanzas de 2 o más distribuciones sin la condición de realizar el supuesto de que los términos de error se distribuyen normalmente. La hipótesis nula establece que µ1=µ2=,...,=µa, donde µi representa la esperanza del i-ésimo tratamiento, con i=1, 2,....,a. Esta prueba se aplica cuando se tienen muestras independientes de cada población, con observaciones de naturaleza continua y las varianzas poblacionales son iguales. El estadístico de la prueba (H) se basa en la suma de los rangos asignados a las observaciones dentro de cada tratamiento. Su distribución exacta es obtenida a partir de la consideración de todas las configuraciones posibles de los rangos de N observaciones en a grupos de ni observaciones cada uno. Existen algunas maneras de solucionar o minimizar el problema de falta de normalidad y de varianza heterogénea en los residuos: 1) utilizar métodos de análisis no paramétricos, que no requieren las suposiciones de normalidad y varianza constante 2) hacer el análisis mediante modelos lineales generalizados (GLM), en los que se ajusta un modelo lineal usando otras distribuciones diferentes a la normal, donde la varianza no tiene por qué ser constante y 3) hacer el análisis sobre la respuesta transformada a una escala en la que los supuestos se cumplan.

20 Porcentaje de formación de embriones
73.43% 53.43% Porcentaje de formación de embriones

21 Prueba de Kruskal-Wallis
Embrión corazón Prueba de Kruskal-Wallis De acuerdo al análisis de varianza no paramétrica para el efecto de la concentración del ácido giberélico, se encontró un valor (p< 0,001%), menor al nivel de significación nominal de la prueba (α=5%), por lo que se sugiere el rechazo de la hipótesis de igualdad de las medias de tratamientos (tabla 3.5). Con respecto a la prueba de Kruskal-Wallis (tabla 3.6), se encontró dos grupos estadísticos, donde se observa que las concentraciones de 1.5 y 3 mg L-1 de ácido giberelico con caseína hidrolizada pertenecen al grupo B, y las concentraciones de 1.5 y 3 mg L-1 con agua de coco está en el grupo A, por lo tanto se evidencia que nos existen diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos tres y cuatro.

22 Porcentaje de formación de embriones
25.64% 23.30% Porcentaje de formación de embriones

23 Prueba de Kruskal-Wallis
Embrión torpedo Prueba de Kruskal-Wallis De acuerdo al análisis de varianza no paramétrico para el efecto de la concentración del ácido giberélico, se encontró un valor (p< 0,001%), menor al nivel de significación nominal de la prueba (α=5%), por lo que se sugiere el rechazo de la hipótesis de igualdad de las medias de tratamientos (tabla 3.8). Con respecto a la prueba de Kruskal-Wallis (tabla 3.9), se encontró dos grupos estadísticos, donde se observa que la concentración de 1.5 mg L-1 de ácido giberelico con agua de coco pertenecen al grupo A, y las concentraciones de 3 mg L-1 de ácido giberelico con agua de coco junto a las concentraciones de 1.5 y 3 mg L-1 con caseína hidrolizada, están en el grupo B, por lo tanto se evidencia que los tratamientos dos, tres y cuatro, presentan la media más alta con respecto a la formación de embriones en fase torpedo.

24 Porcentaje de formación de embriones
30.82% 26.34% En la figura 3.18, se identifica los diferentes porcentajes de embriones formados en fase torpedo en los cuatro tratamientos empleados, y en la figura 3.19, se observa un embrión en fase torpedo. En la tabla 3.7, se identificó que la mayor formación de embriones en fase torpedo, se da en el tratamiento tres con un 30,82%, y el menor porcentaje de formación de embriones se observó en el tratamiento uno con un 7,46%. Porcentaje de formación de embriones

25 Prueba de Kruskal-Wallis
Embrión cotiledonar Prueba de Kruskal-Wallis De acuerdo al análisis de varianza no paramétrico para el efecto de la concentración del ácido giberélico, se encontró un valor (p< 0,001%), menor al nivel de significación nominal de la prueba (α=5%), por lo que se sugiere el rechazo de la hipótesis de igualdad de las medias de tratamientos (tabla 3.11). Con respecto a la prueba de Kruskal-Wallis (tabla 3.12), se encontró dos grupos estadísticos, donde se observa que las concentraciones de 1.5 mg L-1 y 3 mg L-1 de ácido giberelico con agua de coco pertenece al grupo A, y las concentraciones de 1.5 mg L-1 y 3 mg L-1 con caseína hidrolizada, están ubicadas en el grupo B, por lo tanto se evidencia que el tratamiento cuatro, presenta la media más alta con respecto a la formación de embriones en fase cotiledonar.

26 Porcentaje de formación de embriones
45.36% 40.79% En la figura 3.20, se identifica los diferentes porcentajes de embriones formados en fase cotiledonar en los cuatro tratamientos empleados, y en la figura 3.21, se observa un embrión en fase cotiledonar. En la tabla 3.10, se identificó, que la mayor formación de embriones en fase cotiledonar se da en el tratamiento cuatro con un 45,36%, y no existieron embriones cotiledonares tanto para el tratamiento uno y dos. Porcentaje de formación de embriones

27 Porcentajes de embriones en sus distintas fases
Se observó mayor presencia de embriones en fase globular en el tratamiento uno, seguido del tratamiento dos, y porcentajes menores en los tratamientos tres y cuatro. El porcentaje de embriones en fase corazón fue mayor en el tratamiento tres, seguido del tratamiento cuatro, y en menor porcentaje en los tratamientos uno y dos, mientras que en fase torpedo, el mayor porcentaje de formación se dio en el tratamiento dos, seguido de los tratamientos tres y cuatro, finalmente se obtuvo porcentajes de formación de embriones en fase cotiledonar solo en los tratamientos tres y cuatro (figura 3.22). Porcentajes de embriones en sus distintas fases

28 Prueba de Kruskal-Wallis
486 429 386 335 Al referirnos a la capacidad embriogénica, en los tratamientos que contenían mg L-1 de GA3 y 200 mg L-1 de caseína hidrolizada, se observó la presencia de embriones en fase cotiledonar. La capacidad embriogénica a las 12 semanas fue del 40.79% al utilizar 1.5 mg L-1 de GA3, y al utilizar 3 mg L-1 de GA3, se obtuvó una capacidad embriogénica del % (tabla 3.15; tabla 3.16). De acuerdo al análisis de varianza no paramétrico para el efecto mayor número total de embriones, se encontró un valor (p< 0,001%), menor al nivel de significación nominal de la prueba (α=5%), por lo que se sugiere el rechazo de la hipótesis de igualdad de las medias de tratamientos (tabla 3.17). Con respecto a la prueba de Kruskal-Wallis (tabla 3.18), se encontró tres grupos estadísticos, donde se observa que el tratamiento uno y dos pertenece al grupo A, el tratamiento tres pertenece al grupo B, y el tratamiento cuatro está ubicado en el grupo C, por lo tanto se evidencia que el tratamiento cuatro presenta la media más alta con respecto al tratamiento con mayor número de embriones.  Finalmente, se obtuvo como resultado total 335 embriones en el tratamiento uno, 386 en el tratamiento dos, 429 en el tratamiento tres y 485 en el tratamiento cuatro, es decir el mayor número de embriones se formaron en el tratamiento cuatro Número total de embriones formados en los cuatro tratamientos

29 CONCLUSIONES El mejor protocolo de desinfección para la inducción de callo, fue utilizando una concentración de NaClO al 2.5%, con un tiempo de inmersión de diez minutos. Se obtuvo un porcentaje de contaminación en la inducción del callo del 1,11%, por lo tanto la sobrevivencia de los embriones fue de 98,89%. El mejor tratamiento para la inducción de callo, fue el tratamiento con (60 mg L-1 2,4 D y 1 g L-1 carbón activado), ya que presentó viabilidad y formación de callos friables. El mejor tratamiento para el establecimiento de las suspensiones celulares, fue el tratamiento con (1.5 y 3 mg L-1 de ácido giberélico con 200 mg L-1 de caseína hidrolizada), ya que presentan la media más alta con respecto a la formación de células en relación al tiempo. El mejor tratamiento para la maduración de embriones, fue el tratamiento con (3 mg L-1 de ácido giberélico con 200 mg L-1 de caseína hidrolizada), ya que se observó embriones en todas las fases, y se obtuvo 45.36% de embriones en fase cotiledonar. El agua de coco como fuente de nitrógeno, no favoreció la obtención de embriones en fase cotiledonar, sin embargo, se obtuvo un 73,43% de embriones en fase globular.

30 RECOMENDACIONES Para el proceso de maduración, se debería probar con la adición de 150 mg L-1 glutamina, que según varios autores incrementa los niveles de aminoácidos libres, y el porcentaje de proteínas; además de mejorar el tamaño de los embriones y su frecuencia de conversión. Para alcanzar un alto grado de sincronización en el crecimiento de los embriones somáticos en un mismo tejido o en suspensión celular, se debería utilizar ácido abcísico (ABA). Realizar un estudio histológico en cada etapa de la embriogénesis somática, para así, determinar los cambios estructurales y morfológicos de los embriones. Es necesario continuar con el proceso de germinación de los embriones y aclimatación de las plántulas, para de esta forma determinar la efectividad del protocolo.

31 AGRADECIMIENTOS Ingeniero Cristian Javier Peña Pontón
M.Sc. Grace Tatiana Páez Barrera Ingeniero Pedro Romero Ingeniera Maria Jose Basantes Ingeniero Segundo Aguilar

32 GRACIAS