Ultra-selección de pacientes con cáncer colorrectal metastásico (CCRm) usando la plataforma de secuenciación de última generación para mejorar la eficacia clínica de la terapia anti-EGFR Joana Vidal1, Mayra Orrillo1, Mª Jose Safont2, Vicente Alonso Orduña3 , Mar Varela4, Josep Tabernero5, Ramón Salazar6, Enrique Aranda7, Elisabeth Gaye1, Clara Montagut1 En representación del Grupo de Tratamiento de los Tumores Digestivos (TTD) Buenos días, antes de empezar me gustaría agradecer al comité científico por darnos la oportunidad de presenter nuestro trabajo 1. Oncología Médica, Hospital del Mar, Barcelona. 2. Oncología Médica, Hospital General Universitario, Valencia. 3. Oncología Médica, Hospital Miguel Servet, Zaragoza. 4. Laboratorio de investigación translacional, Institut Català d'Oncologia-IDIBELL, L'Hospitalet de Llobregat. 5. Oncología Médica, Hospital Universitari Vall d’Hebrón. Barcelona. 6. Oncología Médica, ICO Hospital Duran i Reynals, Hospitalet. Barcelona. 7. Oncología Médica, IMIBIC, Reina Sofía Hospital, Universidad de Córdoba, CIBERONC, Instituto de Salud Carlos III.

Disclosure Information Employment: Oncology Department, Hospital del Mar, Barcelona Consultant or Advisory Role: Merck, Amgen

Introducción El análisis extendido de RAS en pacientes con CCRm es obligatorio para establecer la mejor estrategia terapéutica Estrategias potenciales para aumentar el beneficio de tratamiento anti-EGFR son: Validar otros biomarcadores de respuesta (PIK3CA, BRAF, EGFR ECD) Utilizar técnicas de secuenciación de última generación (NGS) Todos sabemos que en pacientes con CCRm el anàlisis extendido de RAS es mandatorio para establecer la major estratègia terapeutica. Sin embargo no todos los pacientes RAS wt responderan al tratamiento anti-EGFR. Estrategias potenciales para augmentar el beneficio anti-EGFR son: Van Cutsem, AnnOncol 2016; Montagut, Nat Med 2012; Arena&Bellosillo, Clin Cancer Res 2015

Umbral clínico propuesto (MAF) Introducción El análisis extendido de RAS en pacientes con CCRm es obligatorio para establecer la mejor estrategia terapéutica Estrategias potenciales para aumentar el beneficio de tratamiento anti-EGFR son: Validar otros biomarcadores de respuesta (PIK3CA, BRAF, EGFR ECD) Utilizar técnicas de secuenciación de última generación (NGS) Estudios recientes tuvieron como objetivo determinar el umbral óptimo de subclonas RAS mutados para identificar aquellos pacientes con mayor probabilidad de beneficiarse del tratamiento anti-EGFR Estudio Tecnología Umbral clínico propuesto (MAF) Van Cutsem et al JCO 2015 BEAMing 5 % Laurent-Puig et al CCR 2014 qPCR 1 % Santos et al Mol Can Ther 2017 dPCR Todos sabemos que en pacientes con CCRm el anàlisis extendido de RAS es mandatorio para establecer la major estratègia terapeutica. Sin embargo no todos los pacientes RAS wt responderan al tratamiento anti-EGFR. Estrategias potenciales para augmentar el beneficio anti-EGFR son: Van Cutsem, AnnOncol 2016; Montagut, Nat Med 2012; Arena&Bellosillo, Clin Cancer Res 2015

Objetivo Evaluar la relevancia clínica de la tecnología de secuenciación de última generación (NGS) para detectar mutaciones en KRAS (exones 2, 3 y 4), NRAS (exones 2, 3 y 4), BRAF V600E y EGFRS492R en tejido tumoral y su correlación clínica en pacientes con CCRm tratados con quimioterapia más anti-EGFR o anti-VEGF

Material y Métodos Pacientes con CCRm incluidos en 5 ensayos clínicos españoles y 2 series retrospectivas entre Febrero 2003 y Septiembre 2014 tratados con anti-EGFR o Bevacizumab Análisis tejido tumoral Un portaobjetos teñido con H & E para revisión patológica Confirmación del diagnóstico histológico en muestras tumorales Microdisección manual para garantizar un porcentaje mínimo de 70% de células tumorales Diez laminillas de 5μm para extracción de ADN Evaluación mutacional (RAS, BRAF & PIK3CA) Kit Therascreen pirosecuenciación (Qiagen) – 5% sensibilidad de detección (Estándar de tratamiento) Test mutacional de COBAS (Roche Molecular Diagnostics) – 1% sensibilidad de detección Plataforma 454 GS Junior (Roche Molecular Diagnostics) – 1% sensibilidad de detección Incluye detección S492R EGFR ECD Tumor tissue analysis are shown in the slide Mutational assessment (RAS, BRAF & PIK3CA) Therascreen pyrosequencing– 5% detection sensitivity as the standard-of-care COBAS Test Kit– 1% detection sensitivity NGS 454 GS Junior platform– 1% detection sensitivity also includes S492R EGFR ECD previously described by our group as a mechanism of acquired resistance

Diagrama de flujo del estudio N = 581 Muestras de tejido de CCRm previo tratamiento biológico N = 443 Secuenciación por 454 GS Junior N= 138 Baja calidad del ADN N = 380 Resultados evaluables N= 63 Baja cobertura Secuenciación por Therascreen Pyro Secuenciación por Cobas

Características clínicas Resultados Características clínicas Características del tratamiento Total pacientes N=581 Pacientes evaluables N=380 Edad, mediana [rango] 65 [21-88] 65 [32-88] Género, hombre, n (%) 383 (65.9) 243 (63.9) Localización tumoral, n (%) Derecho 123 (21,1) 81 (21.4) Izquierdo 55 (9.4) 36 (9.4) Transverso 46 (7.9) 27 (7.1) Recto 218 (37.5) 140 (36.8) No especificado 139 (23.9) 95 (25) Estadio, n (%) I + II 50 (8.6) 31 (8.2) III 137 (23.6) 89 (23.4) IV 381 (65.6) 253 (66.6) Desconocido 13 (2.3) 7 (1.8) Localización M1, n (%) Hígado 390 (67.1) 256 (67.4) Nodos linfáticos 97 (16.7) 67 (17.6) Peritoneo 97 (16.9) 63 (16.6) Pulmón 193 (33.2) 128 (33.7) Otros 87 (15) 57 (15) Total pacientes N=581 Pacientes evaluables N=380 Línea tratamiento, n (%) 1ra 390 (67.2) 257 (67.6) 2da 98 (16.9) 60 (15.8) Otras 50 (8.6) 37 (9.7) Desconocida 43 (7.4) 26 (6.8) Tratamiento biologico, n(%) Anti-EGFR 253 (43.5) 161 (42,4) Bevacizumab 324 (55.8) 215 (56.6) Otro 4 (0,7) 4 (1) ´Aquí podemos observar las características clínicas y de tratamiento de los pacientes. Una majoria de varones, con edad media de 65 años, una importante prevalencia de neoplàsies de recto (aunque vemos que en una cuarta parte de los pacientes no disponemos de lateralidad). El 67% de pacientes analizados recibían tratamiento de primera línia.

Resultados Distribución de mutaciones según técnica de secuenciación (N=380) NGS (454 GS JUNIOR) 4% 38% 20% 5% 31% THERASCREEN PYRO COBAS 5% 35% 13% 4% 43% 36% 6% 41% Entramos ya en los resultados. Primero analizamos la distribución de mutaciones detectadas según técnica de secuencuación. Como era de esperar se detectan un mayor numero de tumores mutados por NGS siendo un 57% mutats per Therascreen i 69% per NGS resultados estadísticamente significativos. No se detectó ninguna mutación en EGFR. KRAS 2 KRAS 3,4 & NRAS 2,3,4 BRAF_V600E PIK3CA Nativo Mayor detección mutaciones por NGS (p = 0.014) No se detectaron mutaciones en EGFR ECD

Tasa de respuesta global en pacientes tratados con anti-EGFR (n = 161) Resultados Tasa de respuesta global en pacientes tratados con anti-EGFR (n = 161) THERASCREEN PYRO COBAS NGS 454 GS JUNIOR Nativo MUT n TRG% KRAS 2  RC 4 35.4 5.9 33.3 12.5 31.3 32.7 RP 46 1 44 2 31 16 EE 49 6 50 5 38 17 PE 26   22 9 Desconocido 21 18 All RAS 37.5 18.4 34.6 24.0 3 28.1 34 12 25 35 20 30 13 19 7 All RAS o BRAF 40.6 16.7 36.6 37.8 26.4 37 10 33 36 24 14 15 All RAS o BRAF o PiK3CA 41.5 17.9 38.2 21.4 42.4 24.2 11 De los 116 pacientes tratados con anti-EGFR la respuesta radiologica fue evaluable en 137 pacientes. Es importate destacar que aproximadamente u 15% de ellos recivieron tratamiento anti-EGFR en monoterapia y un 20% en seguna línea o posteriores. Cuando incluimos el anàlisis de allRAS, BRAF y PI3K la respuesta radiologia aumenta hasta un 41.5% con pyrosecuenciación, un 38% con cobas y un 42.5% por NGS en aquellos pacientes all WT. Sin embargo la respuesta radiològica no es superior cuando bajamos el límite de sensibilidad de mutaciones del 5 al 1% RC: respuesta completa; RP: respuesta parcial; EE: Enfermedad estable; PE: Progresión de la enfermedad; TRG: Tasa respuesta global

Correlación entre FAM detectada por NGS y respuesta al tratamiento Resultados % de la mayor FAM por NGS 1% Correlación entre FAM detectada por NGS y respuesta al tratamiento Mejor respuesta al tratamiento anti-EGFR Mejor respuesta al tratamiento con Bevacizumab N 4 47 55 31 10 74 82 27 * FAM Mediana incluyendo pacientes nativos como FAM = 0 0.55 0.77 2.20 11.29 18.71 19.88 14.70 14.94 RC RP EE PE Observamos una correlación inversa entre la proporción de DNA mutado y la major respuesta a terapia anti-EGFR. Por el contrario, no se observe ninguna asociación enre el porcentaje de fracción alélica mutada y la respuesta a bevacizumab.   RC RP EE PE RC: respuesta completa; RP: respuesta parcial; EE: Enfermedad estable; PE: Progresión de la enfermedad;

Mediana (mut/nativo), mes Resultados Supervivencia libre de progresión en pacientes tratados con anti-EGFR (n = 161) THERASCREEN PYRO COBAS NGS 454 GS JUNIOR MUT NATIVO KRAS 2 n 17 144 16 145 49 112 Mediana (mut/nativo), mes 4.14 7.10 7.1 7.92 5.82 HR (95% IC) 0.78 (0.45-1.33) 0.74 (0.42-1.06) 1.13 (0.77-1.66) P 0.354 0.299 0.540 All RAS 50 111 82 79 4.44 7.20 4.73 7.2 7.03 6.97 0.59 (0.40-0.87) 0.77 (0.52-1.15) 0.83 (0.58-1.19) 0.007 0,203 0.315 All RAS o BRAF 61 100 59 102 87 74 4.11 7.56 0.48 (0.33-0.69) 0.67 (0.45-0.98) 0.79 (0.55-1.14) 0.0001 0.036 0.204 All RAS o BRAF o PiK3CA 68 93 71 90 95 66 8.84 8.08 5.91 0.52 (0.37-0.73) 0.52 (0.36-0.75) 0.67 (0.46-0.97) 0.001 0.033 Seguidamente analizamos la supervivencia libre de progression de los pacientes tratados con anti-EGFR. Igual que para la tasa de respuesta la supervivencia libre de progression mejora en aquellos pacientes all wt. sin embargo vemos como NGS no mejora la selección de pacientes comparados con la técnica estándar con una HR de 0-67 vs. 0.52 Ajustado por edad, genero y líneas de quimioterapia

Resultados Supervivencia libre de progresión en pacientes tratados con anti-EGFR (n = 161) THERASCREEN PYRO COBAS NGS 454 GS JUNIOR Supervivencia libre de progresión (probabilidad) Tiempo (meses) RAS o BRAF o PIK3CA mut (n=67) RAS+BRAF + PIK3CA wt (n=93) Mediana 4.14 8.84 HR (95% IC) 0.52 (0.37-0.73) P 0.0001 RAS o BRAF o PIK3CA mut (n=71) RAS+BRAF + PIK3CA wt (n=90) Mediana 4.14 8.08 HR (95% IC) 0.52 (0.36-0.75) P 0.001 RAS o BRAF o PIK3CA mut (n=95) RAS+BRAF + PIK3CA wt (n=66) Mediana 5.91 7.20 HR (95% IC) 0.67 (0.46-0.97) P 0.033 Aquí podemos ver los mismos resultados de forma más gràfica, con curvas de SLP ajustades por edad, genero y línia de QT. Como decíamos vemos como therascreen pyro con un Umbral de detección del 5% selecciona major a los pacientes que pueden beneficiarse de tratamientos antiEGFR. De nuevo las SLP observada es menor que en ensayos clínicos pivotales porqué como hemos comentado un 15% son pacientes tratados e monoteràpia. Ajustado por edad, genero y líneas de tratamiento

Supervivencia global en pacientes tratados con anti-EGFR (n = 161) Resultados Supervivencia global en pacientes tratados con anti-EGFR (n = 161) THERASCREEN PYRO COBAS NGS 454 GS JUNIOR Tiempo (meses) Supervivencia global (probabilidad) Tiempo (meses) Supervivencia global (probabilidad) Supervivencia global (probabilidad) Tiempo (meses) RAS o BRAF o PIK3CA mut (n=67) RAS+BRAF + PIK3CA wt (n=93) Mediana 12.29 20.67 HR (95% IC) 0.39 (0.25-0.60) P 0.0001 RAS o BRAF o PIK3CA mut (n=71) RAS+BRAF + PIK3CA wt (n=90) Mediana 12.95 21.75 HR (95% IC) 0.38 (0.24-0.59) P 0.0001 RAS o BRAF o PIK3CA mut (n=95) RAS+BRAF + PIK3CA wt (n=66) Mediana 15.15 19.72 HR (95% CI) 0.59 (0.38-0.93) P 0.023 Finalmente analizamos la supervivència global en los pacientes tratados con anti-EGFR. Una vez mas vemos que, aunque la SG es superior en pacientes wt. En todas las técnicas la selección de pacientes wt mediante NGS no es superior respecto a la técnica estándar. Ajustado por edad, genero y líneas de tratamiento

Conclusiones NGS detecta un 10% más de mutaciones en RAS/BRAF que el estándar de tratamiento No se detectaron mutaciones en EGFR ECD en pacientes anti-EGFR naïve El beneficio (TRG, SLP, SG) a anti-EGFR fue superior en pacientes cuádruple (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA) nativos Aumentar la sensibilidad de detección de mutaciones a 1% FAM en muestras de tejido mediante técnicas de NGS no mejora la selección de pacientes candidatos a tratamiento anti-EGFR El umbral de detección de mutaciones del 5% en tejido es el mejor predictor de respuesta a tratamiento anti-EGFR en pacientes con CCRm En conclusion: El análisis de muestras de CCR mediante NGS detecta un 10% más de mutaciones en RAS y BRAF que el estándar de tratamiento. Confirmando los resultados de nuestros estudios previos, no se detectaron mutaciones en el dominio extracellular de ESGF en pacientes anti-EGFR naïve. El beneficio clínico a anti-EGFR tanto en tasa de respuesta global, SLP y SG fue superior en pacites cuádruple wt Aumentar la sensibilidad de mutacions al 1% mediate técnicas de NGS no majora la selección de pacientes candidatos a anti-EGFR el Umbral de detección del %% en tejido es el major predictor de respuesta a ati-EGFR en pacientes con CCRm.

Agradecimientos Los autores agradecemos la colaboración de los pacientes, sus familias y los centros participantes del estudio El soporte eonómico para este studio se ha financiado parcialmente mediante una beca de Amgen S.A. El análisis estadístico fue financiado por Amgen S.A. y proporcionado por Anaïs Estrada-Gelonch y Marta Muñoz-Tudurí de TFS desarrollo