Unidad de Biología Parasitaria Cátedra de Inmunología Bases Inmunológicas, Bioquímicas y Moleculares del Parasitismo Unidad de Biología Parasitaria 2008 Modulación de la respuesta de las células T-CD4+ en las infecciones por parásitos Sylvia Dematteis Cátedra de Inmunología Dpto. de Biociencias Facultad de Química

Función del sistema inmune : PROTEGER AL INDIVIDUO DE LAS INFECCIONES Sistema inmune reacciona frente a la infección Respuesta Respuesta Innata adaptativa - actúan interreguladamente - defasaje cronológico

Regulación de la respuesta inmune por citoquinas Las citoquinas son proteínas secretadas por células que actúan como un sistema integrado de señales entre las células, permitiendo una respuesta inmune integrada. Regulan importantes funciones biológicas: proliferación activación sobrevida muerte diferenciación celular Célula blanco Citoquinas Receptores para Citoquinas

Efectos autócrinos parácrinos : locales sistémicos Reguladores de la respuesta innata y adaptativa Regulación inhibidores proliferación celular estimuladores secreción citoquinas secreción moléculas tóxicas diferenciación celular

Efectos parácrinos locales IL-2 Efectos autócrinos T B Efectos parácrinos locales

Efectos parácrinos sistémicos Hepatocito Hígado Síntesis Proteínas del Complemento IL-6

En 1986, Mosman y Coffman decriben la existencia dos subpoblaciones de células T-CD4+ , (Th1 y Th2) Th1 Th2 IL-2 IFN- TNF- IL- 4 IL-5 IL-10

Infecciones parasitarias inducen respuestas polarizadas Parásito Intracelular Parásito Extracelular Th1 Th2

Características del sistema hospedador-parásito condicionan la inducción y el establecimiento de respuestas de citoquinas tipo Th1 / tipo Th2 1- tipo de parásito y estadío 2- características genéticas del hospedador 3- citoquinas secretadas tempranamente 4- vías de entrada del parásito 5- participación de células no-T en la respuesta al parásito 6- interregulación negativa entre citoquinas tipo Th1 / tipo Th2 7- dosis de parásitos a la que se expone el hospedador

Leishmania major Características genéticas del hospedador C57Bl/6 C3H Balb/c CBA Resistentes Susceptibles Th1 Th2

La activación selectiva de los diferentes subset de células Th tiene un papel importante en la respuesta inmune contra patógenos, asi como en la patogénesis de enfermedades inflamatorias. Para entender esto, es bien importante poder disecar las vías y redes regulatorias que llevan al desarrollo de una determinado subset de células T-CD4+

- Citoquinas (DC y otras células) - nivel de estimulación por el TCR - tipo de señales co-estimuladoras Integración de cascadas de señalización - activación de la expresión de factores de transcripción específicos de cada subset de células T-CD4+ - COMPROMISO con un fenotipo - ESTABILIZACIÓN del fenotipo adquirido Las señales recibidas por las diferentes cascadas de señalización son integradas por las células, lo que va a resultar en el compromiso con la diferenciación a un determinado fenotipo, activándose la expresión de factores de transcripción específicos de cada linaje. Estos factores de transcripción regulan la expresión génica al unirse a elementos en cis a los loci de los genes que van a activar o inhibir. Los factores de transcripción reclutan complejos de remodelado de la cromatina, que hacen más accesible la transcripción de los genes para las citoquinas del fenotipo con el que la célula se ha comprometido y silenciando los de las citoquinas características de los fenotipos opuestos. El remodelado de la cromatina implica cambios en la estructura del DNA, por ej re-posicionando los nucleosomas, descompactando cromatina condensada, modificando las histonas por acetilación, metilación del DNA, etc (epigenética). Estas modificaciones epigenéticas van a ser importantes para fijar de cierto modo el patrón de expresión génica, y estabilizar el fenotipo adoptado. Además son heredables de células madres a hijas y Puede resultar por ej en silenciamiento de los genes característicos de los fenotipos opuestos.

Cambios epigenéticos Adaptado de Murphy, 2002

Polarización Th1/Th2 está mediada por factores de transcripción claves 1- NFAT: activados por la interacción del TCR. 2- Factores de Transcripción Linage Específicos: T-bet GATA-3 En T-CD4+ vírgenes están a niveles basales bajos.

Th2 Célula T-CD4+ no diferenciada Th1 Gusanos Parásitos (helmintos) GATA-3 STAT-6 Gusanos Parásitos (helmintos) Célula T-CD4+ no diferenciada IL-4 IL-4 IFN- IL-12 Th1 T-bet STAT-4 Parásitos intracelulares IFN-

Señales que llevan a la diferenciación Th1 Induce IL-12R2 e IFN- inducido por STAT1 induce IL-12R2 e IFN- activo une GATA-3 y lo secuestra NFAT: nuclear factor of activated T cells; STAT: signal transducer and activator of transcription; T-bet: T-box expressed in T cells Adaptado de Rautajoki, 2008

La diferenciación Th1 está mediada por T-bet inducido por STAT1 induce IL-12R2 e IFN- activo une GATA-3 y lo secuestra Induce: IL-12R2 e IFN-

Señales que guían la diferenciación Th1 Adaptado de Weaver, 2007

Resumen: En la diferenciación a Th1 El compromiso inicial con el subset de células T-CD4+ depende de citoquinas que están en el microambiente en donde las célula Th es activada y que son producidas por células del sistema innato (NK )  IFN /STAT1 El factor de transcripción específico que dirige la diferenciación es: T-bet  IFN/IL12R2 Las señales a partir de IL-12 e IL-18 (STAT4) estabilizan el fenotipo

Mecanismos efectores activados por células Th1 T-CD4+ vírgen T-CD8+ virgen Célula B Ag IFN IL-2, IFN Ag Ag Th1 IgG2a, IgG3 opsonizan, fijan complemento IFN T-CD8+ citotóxica Activación de macrófagos Opsonización y fagocitosis

Th2 Célula T-CD4+ no diferenciada Th1 Parásitos extracelulares GATA-3 STAT-6 Parásitos extracelulares (helmintos) Célula T-CD4+ no diferenciada IL-4 IL-4 IL-12 Th1 T-bet STAT-4 Parásitos intracelulares IFN-

Señales que dirigen la diferenciación Th2 Potencia transcripción en locus citoquinas Th2 Inhibe expresión de STAT4 Induce GATA3 NFAT: nuclear factor of activated T cells; STAT: signal transducer and activator of transcription; Adaptado de Rautajoki, 2008

La diferenciación Th2 está mediada por GATA3 Induce GATA3 Potencia transcripción en locus citoquinas Th2 Inhibe expresión de STAT4

Adaptado de Weaver, 2007

Resumen: En la diferenciación Th2: El compromiso inicial con el linaje depende de citoquinas que están en el microambiente en donde la células Th es activada y son producidas por células del sistema innato (basófilos)  IL-4/STAT6 El factor de transcripción específico del subset Th2 que dirige la diferenciación es GATA3 IL-4/IL-5/IL-13 Señales autócrinas (IL-4) estabilizan el fenotipo

Mecanismos efectores activados por las células Th2 T-CD4+ vírgen Célula B Ag Inhibición de respuestas inflamatorias IL-4 IL-4, IL-10 Th2 IL-5 Activación, diferenciación de eosinófilos IgE IgG1 Ac neutralizantes Desgranulación de mastocitos

Interregulación negativa entre subpoblaciones Th1 y Th2 Inhibe la activación Th1 _ _ _ _ IFNg Promueve la diferenciación Th1 + + + + Th1 Th2 Inhibe la proliferación Th2 _ _ _ _ IL-4 IL-10 Promueve la diferenciación Th2 + + + +

Th2 Célula T-CD4+ no diferenciada Th1 Treg Parásitos extracelulares (helmintos) GATA-3 STAT-6 IL-4 Célula T-CD4+ no diferenciada IL-4 Th1 IFN-; IL-12 Parásitos intracelulares T-bet STAT-4 IFN- TGF- Treg Foxp3 TGF- IL-10 Inmunosupresión

Polarización de células Th está mediada por factores de transcripción claves 1- NFAT: activados por la interacción del TCR. 2- Factores de Transcripción Linage Específicos: T-bet GATA-3 Foxp3 En T-CD4+ vírgenes están a niveles basales bajos.

CélulasT-CD4+ reguladoras (Treg) - Proporción estable y funcional (5-10%) de las células T-CD4+, - expresan CD25, factor de transcripción FoxP3, - Secretan IL-10 y/o TGF- Principal función de IL-10 : control de la inflamación, limita la inmunopatología

Interregulación negativa entre subpoblaciones Th1 y Th2 Inhibe la activación Th1 _ _ _ _ IFNg Promueve la diferenciación Th1 + + + + Th1 Th2 Inhibe la proliferación Th2 _ _ _ _ IL-4 IL-10 Promueve la diferenciación Th2 + + + +

Th2 Célula T-CD4+ Th1 no diferenciada Th17 Treg Parásitos extracelulares (helmintos) GATA-3 STAT-6 IL-4 Célula T-CD4+ no diferenciada IL-4 Th1 IFN- IL-12 Parásitos intracelulares T-bet STAT-4 IFN- Th17 TGF- Bacterias extracelulares Autoinmunidad IL-6 STAT-3 IL-17 TGF- Treg Foxp3 TGF- IL-10 Inmunosupresión

Es la primera evidencia del rol patogénico de Th17 El desarrollo de Schistosomiasis murina severa se correlaciona con altos niveles de IL-17 Es la primera evidencia del rol patogénico de Th17 en enfermedades parasitarias

Diferenciación de células Th17 (IL-6+TGF-) Estabilización IL-23 (células dendríticas) IL-17 IL-17 IL-22 IL-21 Adaptado de Bettelli, 2007 Amplificación

La diferenciación Th17 está mediada por ROR-t STAT3 induce ROR-t, y este a las citoquinas Th17 efectoras (IL-17 e IL-22)

Adaptado de Weaver, 2007

Interrelación con T-reg TGF - inducción de T-reg en la periferia secretado por Treg para limitar el desarrollo y función de las poblaciones Th efectoras: Th1 y 2 (Th17??) DCreg TGF El descubrimiento de que tgfb estaba involucrada en la diferenciación a Th17 fue bastante llamativo, ya que esta citoquina esta implicada en la inducción de células Treg FoxP3+ en la periferia y además forma parte de los mecanismos de supresión que utilizan estas células reguladoras para limitar el desarrollo y función de las T efectoras, por lo menos de las Th1 y Th2. Se sabe que FoxP3 antagoniza la función de RORgt y RORa, por lo que TGFb al inducir la expresión de FoxP3 suprime las señales que puedan inducir un fenotipo Th17. Lo que todavía no se ha demostrado es si los mecanismos de supresión de las Treg pueden afectar también a las Th17. La inducción y función de Treg y el mantenimiento de la homestasis se va a mantener siempre y cuando se mantengan altos los niveles de TGFb y bajos de IL6 e IL23. Homeostásis: TGF  IL-6

IL-6 HOMEOSTASIS TGF  Treg INFLAMACIÓN TGF  Th17 IL-6 inhibe la expresión de FoxP3 IL-6 IL-6 INFLAMACIÓN TGF  Th17 En el caso que ocurra una infección, las CD van a producir grandes cantidades de IL-6 e IL-23 en respuesta al reconocimiento de los patógenos por sus receptores: TLR, lectina, etc. La Il-6 va a inhibir entonces la generación de Treg suprimiendo la expresión del factor de transcripción específico de este linaje de T: FoxP3, a la vez que junto a TGFb y luego IL-23 promueve la generación de Th17. EL nivel de producción de IL-6 va a actuar como un interruptor que determina que se mantenga la homeostasis mediante la actividad de Treg o se favorezca la inducción de respuestas inflamatorias con activación de Th17 en respuesta a la infección. En respuesta a una infección: IL-6 dispara las respuestas Th17

Interrelación Treg- T efectoras: Infección tardía – reclutamiento de Th1/Th2 inhibición de Th17 (IFN o IL-4): (Treg/Th17) Resolución de la infección Luego durante la infección tardía, llegan las células Th1 o Th2 desde el bazo y los nodos linfático para colaborar en la erradicación de la infección. Estas células efectoras, mediante la producción de IL-4 e IFNg inhiben a las Th17 y a la vez estimulan a las Treg e inhiben a las Th17 mediante la secreción de IL-2. Por lo tanto, cuando se termina de resolver la infección y caen las señales inflamatorias, las Treg dependientes de TGFb vuelven a dominar en el mantenimiento de la homeostasis de las mucosas T-reg dependientes de TGF- vuelven a dominar: HOMEOSTASIS IFN

Interregulación entre las diferentes subpoblaciones de células T-CD4+ Th1 IFN- IFN- Th2 IL-4 IL-4 Th17 IL-6 IL-17 T-reg TGF- IL-10

Parásitos Helmintos Ascaridas Nematodes Filarias Gusanos parásitos Trematodes Plathelmintos Cestodes

Entre todos hay diferencias: Estructurales Formas de transmisión Localización en el hospedador, etc. Gusanos parásitos: -muy heterogéneo de organismos, -gran multiplicidad de mecanismos, Estudiar habilidad de modular la respuesta inmune del hospedador

Parasitosis: infecciones crónicas refleja una inmunomodulación exitosa Cronicidad - Mecanismo modulación compartido

Inmunobiología de estos parásitos observaciones conservadas entre todas las especies: 1.- las infeccciones con estos parásitos inducen una respuesta de citoquinas tipo Th2. 2.- asociadas con alta producción de anticuerpos de isotipo IgE e IgG4 3.- secreción de citoquinas anti-inflamatorias (IL-10) 4.-asociadas con inmunosupresión (ej. No respuestas de linfocitos a Ags o mitógenos) 5.- Evidencias: infecciónes están asociadas a la inducción de células Treg o Th17

El resultado de estas observaciones: la infección por helmintos Fenotipo tipo Th2 Rol en la protección??

Hay evidencias utilizando modelos experimentales: 1.- los componentes de la respuesta tipo Th2 pueden facilitar la expulsión de nematodes gastrointestinales. 2.-previenen al hospedero de la patología mediada por respuestas tipo Th1 (ej. en la schistosomiasis murina la deposición de huevos en el hígado asociado a Th1)

Infecciones experimentales (modelo ratón)

Características del sistema hospedador-parásito condicionan la inducción y el establecimiento de respuestas de citoquinas tipo Th1 / tipo Th2 1- tipo de parásito y estadío 2- características genéticas del hospedador 3- citoquinas secretadas tempranamente 4- vías de entrada del parásito 5- participación de células no-T en la respuesta al parásito 6- interregulación negativa entre citoquinas tipo Th1 / tipo Th2 7- dosis de parásitos a la que se expone el hospedador

Asociado con la cepa de ratón (genotipo del hospedero) Nematodes Ocupan diferentes nichos en su hospedero : tracto gastrointestinal Algunos de estos parásitos en modelos experimentales: Son expulsados Otros producen infecciones crónicas Asociado con la cepa de ratón (genotipo del hospedero)

Nematodes gastrointestinales que actúan en muy diferente forma: Heligmosomoides polyyrus Establece infecciones crónicas Induce un distintivo fenotipo inmunosupresor Inhibe la expulsión de otros parásitos, convirtiendo por ej. la infección por N. brasiliensis en infección crónica A nivel celular la infección con H.polygyrus estimula las células Treg Heligmosomoides polygirus Balb/c o C57Bl/6 Infección crónica Inducción de T-reg.

Nipostrongylus brasiliensis Es de corta vida en la dosis estandar usada (alta) Estimula una fuerte respuesta Th2, protectora Sin embargo a dosis bajas, induce una infección crónica Nipostrogylus brasiliensis Todas las cepas Fuertes respuestas Th2 (a dosis alta: expulsión a dosis bajas: cronicidad)

La suceptibilidad está asociada con una fuerte respuesta Th1. Trichuris muris La suceptibilidad está asociada con una fuerte respuesta Th1. Los ratones fallan en desarrollar una respuesta Th2 Desarrollan una infección crónica con fuertes respuestas Th1 Inducción de respuestas Th1 que favorecen la cronicidad de la infección Trichuris muris AKR

N.brasiliensis es la infección en ratón que induce una clásica respuesta tipo Th2

NES induce una respuesta tipo Th2 sin el requerimiento del parásito vivo. Genera una respuesta tipo Th2, ya sea si es administrado soluble o en adjuvante completo de Freund (el cual normalmente favorece respuestas Th1). la respuesta tipo Th2, en esta parasitosis, no se da simplemente por defecto de una respuesta tipo Th1

Características de la respuesta tipo Th2 en este sistema: Utilizando diferentes aproximaciones experimentales (ej. ratones deficientes en células B, knockout IL-5, etc.) -Eosinófilos -Células T-NK -Células B NO tienen un rol central en la iniciación de la respuesta tipo Th2 en esta parasitosis.

Otras señales serían necesarias para iniciar la IL- 4 por si misma tampoco sería escencial para iniciar una respuesta Th2 (ej. knockout en IL-4R) Otras señales serían necesarias para iniciar la diferenciación Th2.

Si bien NES comparte algunas características con antígenos de otros helmintos, tiene muchas diferencias importantes Diferentes parásitos han desarrollado diferentes mecanismos que producen un efecto similar

La gran diversidad de moléculas que estimulan respuestas tipo Th2: 1.- diferentes helmintos han desarrollado independientemente una variedad de vías que estimulan las respuestas Th2 2.- esto ha sido seleccionado positivamente durante la evolución para conferir una ventaja biológica a cada especie de parásito.

La inducción de respuestas Th2, requiere un involucramiento inicial de las células dendríticas. Para las respuestas Th1, se ha establecido claramente que las células dendríticas presentan antígenos de bacterias o protozoarios, secretan IL-12 y aumentan la expresión de CD80 y CD86 (coestimuladores).

Cómo las DCs inducen respuestas Th2 es más controversial: Hay una particular secreción de citoquinas junto con ligandos de superficie que las DCs expresan para iniciar una respuesta Th2? O es la falta de suficientes moléculas que guien la diferenciación Th1, y por defecto, se induce una

Muchos sistemas experimentales han mostrado que la inducción Th2 puede se reproducir in vitro simplemente por exposición de las DCs a antígenos de helmintos y luego transfiriendo las DCs pulsadas a recipientes vivos. Entre esos antígenos tenemos: ES-62 de la filaria Acanthcheilomena vitese SEA, el antígeno soluble de huevo de Schistosoma mansoni El glicano lacto N-fucopentosa III de S. mansoni NES de N. brasiliensis

Modelo del desarrollo de las células Th1 / Th2

Tanto para la diferenciación Th1 o Th2 el antígeno es presentado por DCs a las células TCD4+ virgenes. Interacción de moléculas coestimuladoras: CD40-CD40L , OX40-OX40L, CD80-CTLA4/CD28 citoquinas del microambiente promueven : diferenciación a Th1 secretoras de IFN- o la diferenciación células Th2 secretoras de IL-4.

Se ha propuesto que diferentes subpoblaciones de DCs denominadas DC1s y DC2s podrían dirigir las vías de diferenciación Th1 / Th2 Ciertos patógenos o patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) dispararían a la APC a través de Toll-like receptors (TLRs) a secretar IL-12 la cual induciría la diferenciación Th1. Señales de traducción y activación de factores de transcripción como (STAT 4) y STAT 1 son activados por la IL-12 y el IFN- respectivamente. T-bet, es un factor de transcripción específico del linage Th1

(B) En el desarrollo Th2, la inhabilidad del antígeno de activar DCs a producir IL-12, resultaría en una vía por defecto de la diferenciación Th2. Además, el antígeno o el microambiente específico del tejido puede activar a las DCs a producir IL- 4 o IL-10, las cuales podrían guiar la diferenciación Th2. STAT 6 es activado especialmente por la unión al IL- 4R. El factor de transcripción, linaje específico Th2, GATA 3 se une a sitios de unión GATA (AGATG).

Th2-cell functions during helminth infection Adaptado de Anthony, 2007

Protective Th2-type response during intestinal nematode infection Adaptado de Anthony, 2007

Adaptado de Anthony, 2007

RESUMEN Los parásitos generan infecciones crónicas que inducen respuestas polarizadas T-CD4+ Varios factores del hospedador, parásito y condiciones de la infección condicionan el tipo de respuesta inducida En general los parásitos intracelulares inducen respuestas tipo Th1 que se asocian con protección Los parásitos extracelulares inducen respuestas Th2 que podrían asociarse a protección, a patología o a mecanismos inmunomoduladores del parásito