Tecnología de DNA Recombinante Biología 10mo Grado Srta. Rosendo

La clonación de un gen contiene: Enzimas – se utilizan para cortar el material genético. Endonucleasas – cortan el ácido nucleico internamente. Exonucleasas – cortan el ácido nucleico en los extremos de la secuencia. Vector (plásmido) – “adoptan” el DNA cortado para ser replicado.

Pasos durante este tipo de experimentaciones Se extrae el DNA. Se corta el DNA utilizando enzimas de restricción. Se une/pega el DNA a un vector de clonación o molécula de interés. Transferir molécula recombinada a un huésped; usualmente, bacterias. Identificar las células transformadas y seleccionar las que tienen la molécula de interés.

EJEMPLOS DE PROCESOS DE TECNOLOGíA DNA RECOMBINANTE Clonación Transformación/transducción PCR Microarreglos Rt-PCR Modificación genética Entre otros

REACCIóN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Protocolo utilizado para copiar el DNA fuera de una célula. Es un proceso que se da “in-vitro”. Muestra de DNA – “template” o molde a ser utilizado; secuencia que se desea duplicar. Primers o cebadores – pequeña cantidad de nucleótidos que se unen a la cadena molde. Indican inicio y final del proceso. Nucleótidos (dNTPs) – son los bloques de construcción para las nuevas copias; son los 4 tipos de nucleótidos trifosfatados. Taq Polimerasa – DNA polimerasa utilizada para los procesos de replicación; la misma puede soportar cambios y elevaciones en temperatura. Buffer – estabiliza el pH de la solución. Compuesto de Cloruro de Magnesio; funciona como un co-factor de la Taq Polimerasa, influyendo en la actividad enzimática. Thermal-Cycler – maquinaria utilizada para realizar el proceso de PCR. Tubo PCR Componentes del PCR: REACCIóN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Pasos en el proceso de PCR

resumen

¿CóMO VISUALIZAMOS LOS RESULTADOS DEL PCR? Los resultados de una reacción de PCR generalmente se visualizan (se hacen visibles) utilizando electroforesis en gel. La electroforesis en gel es una técnica en la que los fragmentos de ADN se extraen a través de una matriz de gel mediante una corriente eléctrica y separa los fragmentos de ADN según el tamaño. Normalmente se incluye un estándar, o escalera de ADN, para que se pueda determinar el tamaño de los fragmentos en la muestra de PCR. Los fragmentos de ADN de la misma longitud forman una "banda" en el gel, que puede verse a simple vista si el gel se tiñe con un tinte de unión al ADN.

Por ejemplo, una reacción de PCR que produce un fragmento de 400 pares de bases (pb) se vería así en un gel:

Usos y aplicaciones del PCR El PCR se usa en muchos laboratorios de investigación, y también tiene aplicaciones prácticas en análisis forense, pruebas genéticas y diagnósticos. Por ejemplo, la PCR se utiliza para amplificar genes asociados con trastornos genéticos del ADN de los pacientes (o del ADN fetal, en el caso de pruebas prenatales). La PCR también se puede usar para detectar una bacteria o virus de ADN en el cuerpo de un paciente: si el patógeno está presente, puede ser posible amplificar las regiones de su ADN a partir de una muestra de sangre o tejido.

Ejemplo: PCR en ciencias forenses Supongamos que está trabajando en un laboratorio forense. Acaba de recibir una muestra de ADN de un cabello que quedó en la escena del crimen, junto con muestras de ADN de tres posibles sospechosos. Su trabajo es examinar un marcador genético en particular y ver si alguno de los tres sospechosos coincide con el ADN del cabello para este marcador.

El marcador viene en dos alelos, o versiones El marcador viene en dos alelos, o versiones. Una contiene una sola repetición (región marrón debajo), mientras que la otra contiene dos copias de la repetición. En una reacción de PCR con cebadores que flanquean la región de repetición, el primer alelo produce un fragmento de ADN 200pb; mientras que el segundo produce un fragmento de ADN 300pb.

Haces el PCR en las 4 muestras de DNA y realizas la corrida de electroforesis; obteniendo los siguientes resultados. Humans are diploid, meaning that they have two copies of most of their DNA. Thus, there will be two copies of the marker we are examining in each of the DNA samples. If a person has two different alleles of the marker (is heterozygous), two different-sized bands (200 bp and 300 bp) will be amplified during PCR. These will appear as bands of DNA in the gel at the 200bp and 300 bp locations. If a person has two copies of the same allele (is homozygous), only one band will be amplified during PCR. If the person is homozygous for the 200 bp allele, only a 200 bp band will be visible on the gel. Similarly, if the person is homozygous for the 300 bp allele, only a 300 bp band will be visible on the gel. The marker genotypes of the DNA samples are: Crime scene DNA: homozygous 200200200 bp allele Suspect 1: homozygous 300 bp allele Suspect 2: heterozygous Suspect 3: homozygous 200 bp allele Both the DNA sample from the crime scene and the DNA sample from suspect 3 are homozygous for the 200 bp version of the marker. That is, the two samples match for this marker.

¿Qué ADN del sospechoso coincide con el ADN de la escena del crimen en este marcador? Ninguno

Información adicional https://www.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna- sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr