HPLC (High-performance liquid chromatography)

Introducción a HPLC Inicialmente se refería a: High Pressure Liquid Chromatography En la actualidad hace referencia a: High Performance Liquid Chromatography

En general… En una cromatografía participan: Fase estacionaria Fase móvil Muestra

¿Cómo interaccionan? En general, una cromatografía se realiza permitiendo que la mezcla de moléculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase móvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a través de ésta para "lavar" (eluir) a las moléculas en la muestra.

HPLC La cromatografía de líquidos de alta resolución, es un modo de cromatografía en la cual el proceso de separación y transferencia de masa es entre la fase estacionaria y la fase móvil y una temperatura dada.

HPLC Es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica.

HPLC La HPLC, representa una de las herramientas más empleadas en el laboratorio analítico moderno. La cromatografía es un método, usado primariamente para la separación de los componentes de una muestra, en la cual los componentes se distribuyen en dos fases. Las muestras no necesitan ser vaporizadas para su análisis. Cualquier sustancia puede ser potencialmente analizada por esta técnica.

HPLC En la HPLC, el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie). Esto lo hace mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria.

Disolventes HPLC Los disolventes más utilizados son: Agua Metanol Acetonitrilo El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos.

Características HPLC Selectividad Reproducibilidad Sensibilidad Rapidez

Parámetros HPLC Naturaleza de la fase estacionaria Tamaño de partícula Eluyente (composición y flujo) Detector Tamaño de poro Presión de la bomba

TIPOS DE HPLC Fase Directa: separa compuestos en base a su polaridad. - Fase estacionaria polar - Fase móvil de baja polaridad - El compuesto de interés a analizar es muy polar Fase Reversa: - Fase estacionaria de polaridad baja - Fase móvil de polaridad alta - El compuesto de interés a analizar es apolar

TIPOS DE HPLC Exclusión molecular ò filtración en gel Separa las partículas de la muestra en función de su tamaño. Útil para la determinación de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las proteínas purificadas. Intercambio iónico La retención se basa en la atracción electrostática entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna.

Tipos de HPLC Bioafinidad Se basa en la capacidad de las sustancias biológicamente activas de formar complejos estables, específicos y reversibles. La formación de estos complejos implica la participación de fuerzas moleculares entre las partículas de la muestra y la fase estacionaria.

Mecanismos de interacción en HPLC Adsorción superficial Partición Intercambio iónico Exclusión molecular

Adsorción superficial La fase estacionaria es sólida. La separación se logra por las diferencias en solubilidad (en fase móvil) y de retención por adsorción (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos.

Adsorción superficial Fases estacionarias más comunes: sílica y alúmina. Tanto las moléculas de solutos como de disolvente son atraídas hacia los lugares activos polares de la fase estacionaria. Unos solutos serán más atraídos que otros por la fase estacionaria y así se logrará su migración diferencial. Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poder de elución y la selectividad adecuadas. Normalmente un disolvente apolar (n-hexano) unido a otro más activo (acetona, cloruro de metilo, etc).

Partición La separación se basa en el reparto o distribución de los solutos entre una fase móvil líquida y otra estacionaria inmiscible, soportada sobre un sólido inerte. La discriminación se produce por diferencias de solubilidad. Las especies más retenidas serán las que presenten mayor afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase móvil (eluyente).

Partición Existen dos modos básicos de operación: - Fase normal. Cuando se trabaja con fase estacionaria polar y fase móvil no polar. - Fase reversa. Cuando se emplea una fase estacionaria no polar y fase móvil polar.

Fase móvil Si es un gas: Modalidad cromatográfica gaseosa. Si es un líquido: Cromatografía líquida.   Cromatografía en capa delgada. Cromatografía líquida en columna abierta HPLC.

Alta pureza (calidad HPLC). Inactividad frente a la fase estacionaria. Baja viscosidad. Compatibles con la muestra. Facilitar la recuperación de la muestra. Compatibilidad con el sistema de detección. Según su composición varíe o no con el tiempo: Elución isocrática Elución en gradiente

Los disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC. La desgasificación reduce el riesgo de formación de burbujas en la columna o en el detector. Posibilidades: Desplazamiento con un gas menos soluble (He) Aplicación de vacío Sonicación Calentamiento

Cromatografía de partición Existen dos modos básicos de operación: Fase normal. Cuando se trabaja con fase estacionaria polar y fase móvil no polar. Fase reversa. Cuando se emplea una fase estacionaria no polar y fase móvil polar. Inicialmente tuvo más auge la fase normal pero en la actualidad son más comunes los métodos cromatográficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofílica delas muestras de mayor interés (clínico, contaminación, alimentos).

Según empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elución de bandas y el tiempo de análisis. Materiales comerciales empleados como soportes en cromatografía de adsorción y partición.

Principales fases moviles en HPLC

Cromatografía de intercambio iónico Tanto fase estacionaria como fase móvil son de naturaleza iónica. La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente.

Se emplean rellenos en los cuales la partícula está constituida por un polímero o por sílica gel

Se emplea para el análisis de todo tipo de iones (inorgánicos y orgánicos). Las moléculas intercambiadoras se ligan a soportes específicos. El material intercambiador de la fase estacionaria es de diámetro de partícula pequeño (1-10 μm) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 – 10-3 meq/g).

Cromatografía de exclusión molecular Emplea materiales de porosidad controlada, que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moléculas de la muestra según un orden decreciente de tamaño molecular. Si se dispone de estándares apropiados, de peso molecular adecuado, puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido

Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte (gel) que permite la discriminación entre los solutos según su tamaño. 􀂃 Los analitos de mayor tamaño no pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria y son excluidos, viajando con la fase móvil en el frente de la misma. Se muestra especialmente útil para determinar el rango molecular de polímeros, proteínas, etc.

Equipos Integrados: Cada una de sus partes están reunidas en un gabinete y su intercambio o conexión con otros componentes es difícil. Modulares: Los módulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo según las necesidades, sino aumentar su complejidad según esa necesidad varíe.

Están formados por: Solvente Bomba de alta presión Inyector Columna Detector Graficador

Solventes Alto poder solubilizante de las muestras. Baja reactividad. Adecuado punto de ebullición. Baja viscosidad. Seguridad. Alto grado de Pureza.

Propiedades químicas: estas propiedades de la fase móvil, son las que establecen el tipo y fuerza de interacción entre el solvente y la muestra, en consecuencia, son determinantes de la separación. Índice de polaridad: Resultante de todas las propiedades químicas e intenta medir cuantitativamente la fuerza de interacción de los solventes frente a solutos polares.

Fuerzas dispersivas: Indican la polarizabilidad de una molécula y aumentan con el número de electrones de la misma y con la distancia de éstos al núcleo. Capacidad aceptora o donadora de protones: Medida de la capacidad de las moléculas de intercambiar protones. Momento dipolar: Se refiere a la capacidad de una molécula para formar dipolos permanentes y está estrechamente relacionado con la constante. dieléctrica del solvente.

Las fases móviles están constituídas por mezclas de solventes polares, en general agua, y un modificador orgánico, con o sin el agregado de aditivos. Dioxano y THF se mezclan tanto con el agua como con solventes no polares, y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa. El agua destilada y desionizada, puede encontrar varias limitaciones en HPLC. La razón de esto reside en la presencia de sustancias orgánicas que no se eliminan con el tratamiento aplicado

Solventes comunes Metanol HPLC. Acetonitrilo HPLC. Tetrahidrofurano HPLC. Dioxano HPLC. Sales de sodio y potasio

BOMBAS Presión estable hasta 5000 psi (400 atm) 1 atm = 14,696 psi Flujo libre de pulsaciones Amplio rango de flujos (0,1 a 10 mL/min) Control, exactitud y reproducibilidad del flujo Componentes químicamente inertes y resistentes a la corrosión

SISTEMAS DE INYECCIÓN Se emplean válvulas inyectoras de volumen (loop) constante. Pueden ser manuales o automáticas. Para variar el volumen de inyección se debe cambiar el “loop” correspondiente. Se debe evitar la entrada de burbujas en el sistema de inyección.

SISTEMAS DE INYECCIÓN Se emplean válvulas inyectoras de volumen (loop) constante. Pueden ser manuales o automáticas. Para variar el volumen de inyección se debe cambiar el “loop” correspondiente. Se debe evitar la entrada de burbujas en el sistema de inyección.

COLUMNAS Gran avance en la última década por el progreso en la tecnología de rellenos y columnas. Rellenos más uniformes y de menor tamaño. Fases químicamente ligadas a los soportes aumentando su eficacia y resolución. Mejora en los métodos de empaquetado.

Las columnas constan de: -Cuerpo – Normalmente de acero inoxidable 316 con diámetro interno de 2.6 a 3 mm o 4.6 a 5 mm. -Relleno – El material de relleno de una columna está constituido por partículas, definidas por una serie de características. (morfología, tamaño, porosidad, estructura química) Al disminuir el tamaño del relleno aumenta la eficiencia pero también la presión de trabajo

Fase Reversa C-2 o RP-2 (-SiCH2CH3) C-8 o RP-8 (-Si-(CH2)7-CH3) C-18 o RP-18 (Si-(CH2)17-CH3) Fase Normal Sílica Alúmina Amino (-NH2) Nitrilos (-CN) Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)

Influencia de la longitud de la columna y del tamaño de partícula en la duración del cromatograma

DETECTORES Se pueden clasificar en: Detectores que miden una propiedad de la fase móvil. (Detector de Indice de Refracción) Detectores que miden una propiedad de los solutos. (Detector de Fluorescencia, Detector Ultravioleta ) Cualquier propiedad física o química que se pueda medir en la disolución podría usarse como método de detección. Los detectores en HPLC no son destructivos

Principales detectores empleados en HPLC UV/Vis Fotodiodos Índice de refracción Fluorescencia Conductividad Dispersión de luz Espectrometría de masas

Detector de Índice de Refracción. Detector UV. Detector de Longitud de Onda Fija Detector de Longitud de Onda Variable Detector de Arreglo de Diodos Detector de Índice de Refracción. Tipo Deflexión Tipo Fresnel Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatización. Detector de Fluorescencia Inducida por Laser Según la Fuente de Excitación Según el sistema óptico

DETECTOR UV/VIS Para sustancias que absorben radiación UV/VIS El más usado Con lámparas de deuterio, xenon o wolframio Desde 190 a 900 nm Camino óptico de la microcelda de un detector UV/VIS. Las celdas ordinarias tienen 0,5 cm de camino óptico y contienen 8 μL de líquido

DETECTOR FOTODIODOS Permite registrar la absorbancia simultánea en todo el rango UV/VIS. La muestra es atravesada por luz blanca (todas las λ) y el policromador dispersa la luz en las diversas λ que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos. En cada diodo incide una λ diferente, que manda la información al sistema de análisis de datos.

DETECTOR DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN Van a medir variaciones en el índice de refracción del eluato con respecto al del disolvente puro. Sólo se pueden usar si la elución es isocrática. Responden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad. Son muy sensibles a las variaciones de temperatura.

FUNCIONAMIENTO DE DETECTORES DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN El disolvente pasa a través de la mitad de una cubeta y el efluente de la columna pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos están separados por una placa de vidrio montada a un ángulo tal que si las dos disoluciones difieren en índice de refracción se produce una desviación del haz incidente.

DETECTOR DE FLUORESCENCIA Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes. Son de alta sensibilidad. No se ven interferidos por los disolventes al no tener éstos naturaleza fluorescente.

DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD Son detectores basados en una respuesta diferencial y no absoluta. Empleados fundamentalmente en cromatografía de intercambio iónico. Inconvenientes: Baja sensibilidad Sensibles a impurezas de la fase móvil.

DIAGRAMA DEL DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD Cuando los iones se mueven en la celda del sensor, la impedancia eléctrica entre los electrodos cambia "fuera de la señal de equilibrio“. Desde el puente se alimenta a un circuito electrónico adecuado.

DETECTOR DE DISPERSIÓN DE LUZ Válido para aquellos solutos que sean claramente menos volátiles que la fase móvil. El eluyente es evaporado con una corriente de N2 dejando una nube de finas partículas sólidas que entran en la zona de detección. Las partículas se detectan por la luz que procede de un diodo láser y llega al fotodetector por dispersión. Sólo tampones volátiles en la fase móvil.

DIAGRAMA DEL DETECTOR DE DISPERSIÓN DE LUZ Se utiliza un spray que continuamente atomiza el eluyente de la columna en pequeñas gotas. Estas gotas se deja evaporar, dejando los solutos como las partículas finas suspendidas en el gas de atomización.

Cuantificación de aminoácidos en plasma. APLICACIONES DEL METODO HPLC Cuantificación de aminoácidos en plasma.

Cromatograma

¿ QUE ES UN CROMATOGRAMA? Es un grafico de la señal de concentración de un analíto en función del tiempo.

RENDIMIENTO DE LA COLUMNA

CONSTANTES DE DISTIBUCION. Es la relación entre la concentración molar del soluto en la fase estacionaria y se concentración molar en la fase móvil. Kc=Cs/Cm En donde Cs es la concentración molar de soluto en la fase móvil y Cm es la concentración del mismo en la fase estacionaria

TIEMPO DE RETECION El tiempo requerido para que el analíto sea detectado después de ser inyectado se conoce como tiempo de retención y se representa mediante el símbolo Tr. El analíto ha sido retenido porque pasa un Ts en la fase estacionaria. Tm es una especie no retenida y representa una mediad de la velocidad media de migración de la fas móvil y es importante para identificar picos Tr= Ts + Tm señal tiempo

FACTOR DE RETENCION Es un parámetro experimental importante que se usa mucho para comprobar las velocidades de migración de solutos en columnas. Ka= Ts/Tm FACTOR DE SELCTIVIDAD El factor de selectividad de una columna proporciona una medida de la eficacia con que la columna puede separarlos.

PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCION