Torres, María Gabriela Noviembre 2011 Residente de 2° Año CEMIC APLICACION DE LA CITOMETRIA DE FLUJO EN EL ESTUDIO DEL SEDIMENTO URINARIO Torres, María Gabriela Noviembre 2011 Residente de 2° Año CEMIC

INTRODUCCION Es una de las pruebas más solicitadas al laboratorio Detección y seguimiento de trastornos renales vías urinarias, enfermedades metabólicas o sistémicas Incluye análisis físico, químico y observación al microscopio

METODOS PARA ANALIZAR EL SEDIMENTO URINARIO METODO TRADICIONAL O MANUAL METODOS AUTOMATIZADOS

ANALISIS DEL SEDIMENTO URINARIO CON EL METODO TRADICIONAL La orina se recoge en un recipiente limpio Examinarse dentro de las primeras 2 horas de haberse realizado la micción o conservarse de 2°a 8°c si esto no fuese posible Recolección : Micción espontánea Chorro medio Punción suprapúbica Punción por sonda

ANALISIS DEL SEDIMENTO URINARIO CON EL METODO TRADICIONAL Análisis físico : Color Aspecto Análisis químico : Ph Densidad Proteínas Glucosa y cuerpos cetónicos Urobilinógeno y bilirrubina Nitritos Hemoglobina libre

ANALISIS DEL SEDIMENTO URINARIO CON EL METODO TRADICIONAL Volumen : 10,12 ml o 15 ml 2000 rpm por 5´ 1 ml sedimento GP16-A2 de CLSI

ANALISIS DEL SEDIMENTO URINARIO CON EL METODO TRADICIONAL Examen directo al microscopio : Eritrocitos : isomórficos dismórficos Glóbulos blancos Células Cilindros Cristales Espermatozoides Mucus Contaminantes Microscopia de contraste de fase

METODO TRADICIONAL Universalización de su uso VENTAJAS Accesibilidad en cualquier tipo de laboratorio Bajo costo DESVENTAJAS Operador dependiente Estandarización del método lo que complica la trazabilidad de los resultados

¿POR QUE ESTANDARIZAR EL METODO TRADICIONAL ? Porque pretende eliminar causas de variación como: Tiempo y velocidad de centrifugación Decantación, volumen de orina y sedimento Superficie de conteo Microscopia e interpretación del personal GP16-A2 CLSI

METODO AUTOMATIZADO

METODO AUTOMATIZADO Condiciones pre analíticas idénticas al método tradicional Análisis químico: Equipo automatizado Urisys que analiza la orina con tiras reactivas Las muestras se colocan en tubos para orina sin centrifugar

METODO AUTOMATIZADO CITOMETRO DE FLUJO UF- 1000i

FUNCIONES DEL CITOMETRO DE FLUJO Conteo y clasificación : - impedancia - óptica Clasifica y cuenta los 5 elementos formes como : RBC (glóbulos rojos) WBC (leucocitos) EC (células epiteliales) CAST (cilindros) BACT (bacterias)

DETECTA Y NO CUENTA: -X´TAL: cristales que no son uratos ni fosfatos amorfos -YLC: levaduras - SRC: células redondas - PATH CAST: cilindros no hialinos - MUCUS - SPERM: espermatozoides

INFORMACION DE ALARMAS MUESTRA NORMAL DISPERSOGRAMAS PARAMETROS REPORTABLES INFORMACION DE ALARMAS

GRAFICOS DE DISPERSION CITOMETRO DE FLUJO

DISPERSOGRAMAS

DISPERSOGRAMAS

DISPERSOGRAMAS

MUESTRA PATOLOGICA PARAMETROS EN INVESTIGACION

CRITERIOS DE ALARMA DE EL CITOMETRO DE FLUJO Establecidas por el fabricante Establecidas por el usuario

CRITERIOS DE ALARMAS ESTABLECIDAS POR EL FABRICANTE

CRITERIOS DE ALARMAS ESTABLECIDAS POR EL USUARIO Se colocan en función de las necesidades del usuario

VALORES DE REFERENCIA

CRITERIO DE ACEPTABILIDAD: Se utilizaron 30 muestras de pacientes con sedimento urinario normal La verificación se llevo a cabo siguiendo normas de guías CLSI: C28-A2 CRITERIO DE ACEPTABILIDAD: LOS RESULTADOS DE NUESTROS 30 PACIENTES DEBEN CAER DENTRO DEL RANGO DE REFERENCIA PROPUESTO POR EL FABRICANTE ACEPTANDO SOLO QUE 3 RESULTADOS CAIGAN FUERA DE DICHO INTERVALO

HISTOGRAMAS DE INTERVALOS DE REFERENCIA CELULAS EPITELIALES BACTERIAS 3,3% 0,0%

HISTOGRAMAS DE INTERVALOS DE REFERENCIA CILINDROS HIALINOS GLOBULOS ROJOS 3,3% 6,7%

HISTOGRAMAS DE INTERVALOS DE REFERENCIA GLOBULOS BLANCOS 0,0%

SE VERIFICA QUE NUESTRO LABORATORIO PUEDE UTILIZAR LOS VALORES DE REFERENCIA PROPUESTOS POR EL FABRICANTE

VERIFICACIONES ANALITICAS

ESPECIFICACIONES ANALITICAS RBC WBC EC CAST BACT LINEALIDAD 5000.0/ul 200.0/ul 30.00/ul 10000.0/ul REPRODUCIBILIDAD -intracorrida % o menos -entrecorrida +/- 10 30 40 20

SE VERIFICO LA LINEALIDAD SEGÚN LA GUIA CLSI :EP6 A

LINEALIDAD BACTERIAS

LINEALIDAD HEMATIES

REPRODUCIBILIDAD

REPRODUCIBILIDAD 1,6% 14,6% 7,5% 9,0% 4,9% 10% 40% 30% 12,6/ul GR CILINDROS BACTERIAS CELULAS GB MEDIA 213,3/ul 12,6/ul 687,3/ul 48,4/ul 719,2/ul SD 3,3 1,8 51,8 4,3 35,0 CV 1,6% 14,6% 7,5% 9,0% 4,9% CVf 10% 40% 30% REPRODUCIBILIDAD ACEPTADA

COMPARACION DE METODOS UF-1000i vs MICROSCOPIA ANALITO CONCORDANCIA MUESTRAS POSITIVAS CONCORDANCIA MUESTRAS NEGATIVAS VPN CELULAS EPITELIALES 92,5% 75,0% 96,9% 93,93% CILINDROS HIALINOS 87,1% 79,2% 91,3% 89,36% GLOBULOS ROJOS 88,5% 94,6% 86,0% 97,5% GLOBULOS BLANCOS 93,8% 94,9% 93,4% 97,7% EP12-A2 CLSI

TABLAS DE CONTINGENCIA CELULAS EPITELIALES NEGATIVE REFERENCE POSITIVE REFERENCE TOTAL NEGATIVE TEST 62 4 66 POSITIVE TEST 2 12 14 64 16 80 CILINDROS HIALINOS NEGATIVE REFERENCE POSITIVE REFERENCE TOTAL NEGATIVE TEST 42 5 47 POSITIVE TEST 4 19 23 46 24 70

TABLAS DE CONTINGENCIA ERITROCITOS NEGATIVE REFERENCE POSITIVE REFERENCE TOTAL NEGATIVE TEST 80 2 82 POSITIVE TEST 13 35 48 93 37 130 GLOBULOS BLANCOS NEGATIVE REFERENCE POSITIVE REFERENCE TOTAL NEGATIVE TEST 85 2 87 POSITIVE TEST 6 37 43 91 39 130

METODO AUTOMATIZADO VENTAJAS DESVENTAJAS Permite optimizar el tiempo Mejorar el rendimiento laboral Disminuir la subjetividad en la interpretación Las muestras no requieren centrifugación Alto valor predictivo negativo DESVENTAJAS Alto costo Las muestras turbias se deben analizar por el método tradicional

TRA: EMERGENCIAS, AMBULATORIOS E INTERNADOS

CANAL ESPECIFICO PARA BACTERIAS Reactivos específicos para bacterias permiten detectarlas y cuantificarlas -Solución colorante -Solución diluyente Utiliza dos soluciones

POSIBLES ESTRATEGIAS DE APLICACION Disminuir cultivos en bacteriología El valor de corte más equilibrado para la sensibilidad y la especificidad fue de 160/μL el recuento de bacterias en la curva de ROC. Con este valor, la sensibilidad fue de 81,1% y la especificidad del 83,2%.En este contexto, el porcentaje de cultivos de orina innecesaria fue de aproximadamente 54,9% de falsos negativos del 10% los resultados. Sin embargo, una mayor sensibilidad se debe obtener para la detección de una infección urinaria. Nuestro laboratorio selecciona los valores más bajos de corte para la carga bacteriana para una mejor sensibilidad. El valor de corte recomendado es 10/μL para el recuento de bacterias, y con este valor, se podría reducir aproximadamente el 24,3% de los cultivos de orina sin ningún tipo de resultados falsos negativos. En este estudio, encontramos que la mayoría de los recuentos bajos de bacterias y las muestras positivas son muestras de la cultura UTI causadas por hongos. Debido a UF-1000i utiliza un canal dedicado de bacterias, los hongos no se contó durante el recuento de bacterias. Por lo tanto, suponemos que el número de bacterias sólo es beneficioso para el diagnóstico de bacterias, mientras que IU no es adecuado para los hongos infección del tracto urinario. 308 muestras 10 bacterias/ul S: 100 % LAS MUESTRAS POR DEBAJO DE ESE PUNTO DE CORTE TUVIERON CULTIVO NEGATIVO PODRIAN HABER EVITADO SEMBRAR 25% DE LAS MUESTRAS

POSIBLES ESTRATEGIAS DE APLICACION Análisis de líquidos de punción Conteo de leucocitos en líquido cefalorraquídeo constituye, además de análisis bioquímicos y Tinción de Gram, una de las piedras angulares del diagnóstico rápido de meningitis por el laboratorio. Técnicas de conteo de la cámara siguen siendo el oro " estándar "para este fin, pero son lentos y tienen múltiples pasos metodológicos que contribuyen a la imprecisión e inexactitud. Hemos explorado el uso de un citómetro de flujo automático de nuevo (Sysmex UF- 1000i) en el diagnóstico rápido de esta emergencia neurológica, y en comparación con el flujo de equipos ya existentes en la citometría de STAT laboratorio. Por lo general, un buen acuerdo se obtuvo entre El recuento de leucocitos en UF-1000i, UF-100 y el recuento de Fuchs Rosenthal cámara. Debido a la UF-100 inicialmente fue desarrollado para el análisis de orina, gating de citometría de flujo para la detección de los glóbulos blancos se ha centrado en neutrófilos. Los errores experimentado previamente con Sysmex UF-100 en la correcta asignación de algunas subpoblaciones linfocitarias puede conducir a una subestimación del número de leucocitos. Esta informaron del hallazgo de [1,3,10] se ha resuelto mediante la UF-1000i. Esto hace que el anteriormente obligatoria reanálisis manual de microscópico del LCR innecesaria cuando UF-1000i utilizando citometría. Correcta clasificación de los linfocitos, CMB es una mejora, porque de hacer la interpretación de la citometría de flujo de datos más sencilla. Conteo rápido de las bacterias podrían ser de interés en el análisis del LCR, donde capacidad de realizar un diagnóstico inmediato tentativa de meningitis tiene importantes implicaciones para la gestión y los resultados de pacientes. Las técnicas convencionales de bioquímicos y microbiológicos a menudo carecen de poder para evaluar la infección bacteriana del SNC rápidamente. En el 25% de los casos de aguda bacteriana meningitis, no se observaron bacterias en la tinción de Gram del LCR inicial, y en el 30 - 40% de estos casos, otros índices comunes indirectos, tales como glucosa en LCR, Proteína total en LCR, y el lactato CSF ​​no son diagnósticos [11-13]. Administración preanalítica de los antibióticos puede dar lugar a falsos negativos cultivos de LCR [14]. PCR para la detección de ADN de la bacteria no siempre es una buena alternativa para el diagnóstico de meningitis bacteriana debido a factores inhibitorios en el CSF puede interferir con esta técnica [15]. En contraste, directa bacteriana contar de la citometría de flujo debe ser menos afectados por tal interferencia y los factores que inhiben. Ruido aparente en UF-100 número de bacterias es reportados en muestras hemorrágico y en las muestras recogidas por drenaje ventricular a pesar de los resultados de Gram tinción negativa y la cultura principales Langlois et al. a los fragmentos de células que se postulan y la sangre plaquetas interferir en la UF-100 número de bacterias en forma de fragmentos de células y bacterias con características similares de citometría de flujo [1]. Esto se conoce problema es mejorado mucho gracias a la cuenta de bacterias dedicada canal de la UF-1000i. No fueron capaces de reproducir la observación realizados por Van Acker et al. [1] siendo que el drenaje ventricular estéril especímenes de 100 UF, de forma sistemática una mayor cantidad de bacterias que estéril la punción lumbar muestras de LCR. Hemos demostrado que una cuenta negativa de bacterias en UF-1000i con un recuento de leucocitos de N5/μl es un factor predictivo para la presencia de una elevada porcentaje de linfocitos y sugerente para la meningitis viral. A lo largo de con la utilización de obtener rápidamente los datos bioquímicos, glóbulos blancos y la mejora bacteriana UF-1000i cuenta con la ayuda del médico para hacer una tentativa rápida diagnóstico de la meningitis viral. Por desgracia, la detección viral no se exigido, pero para una minoría de los ejemplares examinados en este estudio. El diagnóstico de laboratorio de C. neoformans con meningitis pueden ser realiza mediante un examen microscópico del LCR en una preparación con tinta china para la presencia de células de levadura encapsulada, pero el diagnóstico a menudo es se perdió en los pacientes sin aparente infección por el VIH [16]. La UF-100 clasifica correctamente las células de levadura criptocócica en muestras a las que C. neoformans se añadió [1], pero en el presente estudio no pudo detectar las levaduras en una cultura confirmado C. neoformans caso. UF-1000i dio un recuento de levaduras de alta para la misma muestra. La sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivos y negativos de la UF-1000i carga bacteriana en CSF son temas interesantes para futuras investigaciones con un mayor número de casos de meningitis virales, bacterianas y fúngicas. Clínica Chimica Acta 392 (2008) 30–33

El uso de sistema automatizado permite: CONCLUSIONES El equipo responde a todas las especificaciones propuestas por el fabricante, siendo útil clínicamente El uso de sistema automatizado permite: Disminuir la carga de trabajo del laboratorio Acelerar tiempos de respuesta en la entrega de resultados Disminuir errores humanos

CONCLUSIONES No es posible eliminar la lectura microscópica de forma absoluta Estandarizar condiciones pre-analíticas

AGRADECIMIENTOS Dra. Viviana Correa Dra. Natalia Dolcemascolo Dr. Alfredo Martínez Dra. Vanesa Romano Dra. Laura Guerrero A mis compañeros de residencia

MUCHAS GRACIAS

BIBLIOGRAFIA J.R Delanghe et al. Clinica Chimica Acta 301(2000) 1-18.The role of automated urine particle flow cytometry in clinical practice . El sedimento urinario :¿Qué hay de nuevo en algo tan viejo? Fernando Dalet. Comparación del citómetro UF-100i con el sistema Kova y el método convencional para el conteo de leucocitos y eritrocitos en orina. Gómez-Gaviño. Inconvenientes del método manual para la lectura de sedimento urinario. Jiménez-López N.E. Nanos, J.R Delanghe/Clinica Chimica 392 (2008)30-33. Evaluation of Sysmex UF-1000i for use in cerebroespinal fluid analysis. Evaluation of the Sysmex UF-1000i Urine Analyzer as a Screening Test to Reduce the Need for Urine Cultures for Urinary Tract Infection. Xiaozhou Hu, MS, Jie Zhang, MD, Xiaowei Zhang, BS (Department of Laboratory Medicine, Peking University, Third Hospital, Beijing, People’s Republic of China)