Métodos de cultivo

Importancia del cultivo de microorganismos: Obtención de cultivos puros. Análisis morfológico, fisiológico, genético y otras características. Producción. Conteo de colonias (UFC)

¿Qué condiciones requiere el crecimiento microbiano? medio de cultivo: Una solución acuosa con los nutrientes y factores de crecimiento necesarios. Los μorganismos crecen en un medio de cultivo artificial se requieren condiciones como: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno así como un grado correcto de acidez o alcalinidad .

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Según su estado físico Líquidos Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado número de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo. Sólidos Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les añaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo.

Según la naturaleza de sus constituyentes Medios naturales o complejos Están constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal usualmente se complementan con el añadido de minerales y otras sustancias. No se conocen todos los componentes del medio de cultivo, ni las cantidades exactas en que están presentes. Ej. Extracto de carne, extracto de levaduras. Medios sintéticos o definido Se preparan a partir de ingredientes químicamente puros y por lo tanto, Se puede conocer exactamente su composición cuali y cuantitativa. Por su costo sólo se emplean en procedimientos especiales.

E. coli

3. Según sus propósitos de uso Medios de enriquecimiento Al cultivo en medio líquido que resulte en un incremento en el número de un tipo dado de μorganismo en relación con el número de otros tipos de μorganismos que puedan estar en el inóculo. Puede contener sustancias que favorezcan el crecimiento del μorganismo que nos interesa o que inhiban el crecimiento de otro tipo de microorganismos presentes. La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no está determinada únicamente por la composición química, sino que puede ser variada significativamente modificando otros factores tales como: temperatura, pH, fuerza iónica, iluminación, aireación etc.

Ej. Caldo tetrationato y selenito Ej. Caldo tetrationato y selenito. utilizado para el enriquecimiento de las especies del género Salmonella provenientes de muestras de heces, orina, agua o alimentos. Agua de peptona alcalina (Vibrio cholerae) Adición de sangre, suero o extracto de tejidos de animales y plantas.

Medios selectivos Se diferencian de los enriquecidos por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. Ej. CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos, la adición de cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram+, utilizando maltosa como única fuente solo crecerán los que usen maltosa. (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina) Agar Tiosulfato, Citrato, Sales de bilis, Sacarosa (TCBS): Vibrio • Agar Cetrimida: Pseudomonas

Medios diferenciales Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. contienen indicadores de productos derivados de la actividad metabólica de los μorganismos sobre algunos de los componentes del medio. Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar fermentación de carbohidratos . Agar Eosina Azul de Metileno: coliformes y E. coli

Medio de cultivo Tipo de medio Agente bacteriostático Azúcar fermentable Sistema Indicador ALRF (agar lactosa rojo fenol) diferencial (no selectivo) ----- lactosa rojo fenol Agar Cetrimide selectivo bromuro de cetiltrimetil amonio ------- -------- Agar Mac Conkey selectivo y diferencial  cristal violeta, sales biliares rojo neutro SS agar (Salmonella Shigella)  selectivo y diferencial  verde brillante, sales biliares lactosa  rojo neutro,  citrato férrico VRBA (violeta rojo bilis agar) Manitol Salt Agar (Chapman)  selectivo y diferencial cloruro de sodio manitol EMB agar (eosin methylen blue) eosina y azul de metileno XLD agar (xilosa lisina desoxicolato) desoxicolato de sodio lactosa, xilosa, sacarosa rojo fenol, citrato férrico amónico y tiosulfato de sodio BiS agar (bismuto sulfito) verde brillante, sulfito de bismuto glucosa indicador de sulfito de Bi y sulfato ferroso Baird Parker agar  Cloruro de litio y telurito de potasio  ------ yema de huevo, telurito de potasio TSB + 10% NaCl enriquecimiento selectivo  Caldo Tetrationato enriquecimiento selectivo Tetrationato, sales biliares CLBVB (caldo lactosa bilis verde brillante) producción de gas

Medios de mantenimiento Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Ej. Añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento

PREPARACIÓN DE MEDIOS Siempre preparar los medios con agua destilada (salvo el Marino). Es necesario ajustar siempre el pH. Todos los utensilios deben estar perfectamente limpios. Los medios se preparan en matraces cónicos con tapa. Se pesa la cantidad de medio requerida, se disuelve o suspende en el agua. Se esteriliza a 121°C por 20 min Se espera a que enfríe (42°C o hasta que se pueda sostener el recipiente sin quemarse la mano). • Servir 20 ml Aprox. en cada caja de Petri

Métodos especiales de cultivo; Siembra en superficie sobre medio sólido Siembra en profundidad (vertido en placa) Dilución y solidificación en tubo Cultivo en células vivas Cultivo en animales Mycobacterium leprae

Mantenimiento y preservación de cultivos puros. Resiembra periódica en medios frescos. Preservación de cultivos con una capa de aceite mineral.

Liofilización. Proceso utilizado para la eliminación de agua, mediante desecación al vacío y a muy bajas temperaturas. Con crioprotectores leche descremada 10-20%, suero fetal bovino, suero equino, mesclas de suero, glucosa y extracto de levadura. inositol, leche descremada Almacenamiento a temperaturas muy bajas en presencia de agentes estabilizantes como glicerol, dimetilsulfóxido, glucosa, sacarosa , suero de conejo, extracto de malta, nitrógeno líquido, (-196ºC)