CARACTERÍSTICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN MICROBIANA

Se entiende por identificación microbiana al conjunto de técnicas y procedimientos que se aplican para establecer la identidad de un µorganismo. .

Estas técnicas se utilizan en diferentes áreas: En el área clínica es importante conocer cual es el agente causal de la infección que presenta un enfermo para poder tratarlo. Investigación básica donde se aisla un determinado µorganismo que debe identificarse para comprobar si se trata de un µorganismo conocido o de uno nuevo para poder clasificarlo. En la industria de alimentos, donde las normas de control de calidad exige que la fabricación de estos alimentos debe realizarse en áreas controladas con ausencia de ciertos µorganismos, los alimentos son sometidos a una serie de controles microbiológicos para asegurar la ausencia de µorganismos que puedan causar infecciones y/o descartar la presencia de toxinas capaces de causar intoxicaciones alimentarias.

Métodos basados en criterios morfológicos. Los método más utilizados para la identificación microbiana se clasifican en: Métodos basados en criterios morfológicos. Métodos basados en tinción diferencial. Métodos basados en pruebas bioquímicas. Métodos basados en pruebas serológicas. Métodos basados en detección molecular. No todos los µorganismos se identifican por las mismas técnicas, ni con base a un solo método, sino a la combinación de uno o más.

MÉTODOS BASADOS EN CRITERIOS MORFOLÓGICOS. Los rasgos morfológicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas a clasificar organismos. Bajo el microscopio pueden ser tan parecidos dificultándose su clasificación, aún cuando la morfología celular dice poco sobre las relaciones filogenéticas, sigue siendo útil para la identificación bacteriana. Características macroscópicas, en función del tamaño, altura de la colonia, forma, color, olor, textura y grado de adherencia al medio de cultivo. Por ejemplo: la presencia de endosporas y su localización resulta de mucha utilidad para la identificación de bacilos esporulados.

MÉTODOS BASADOS EN TINCIÓN DIFERENCIAL. Es posible sacar conclusiones en relación con la morfología examinando una lamina que fue sometida a un proceso de tinción. Estos criterios morfológicos encabezan la primera etapa del proceso de identificación la mayor parte de la bacterias teñidas con Gram se pueden clasificar como Gram positivas y Gram negativas. Tinciones fluorescentes (naranja de acridina, rodamina, blanco calcofluor) tinción de inmunofluorescencia directa o indirecta. Tinciones vitales. para la visualización de espiroquetas y protozoos. Tinciones acidorresistentes y otras tinciones para detectar capsulas, flagelos, esporas…

MÉTODOS BASADOS EN PRUEBAS BIOQUÍMICAS Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el µorganismo es capaz de fermentar azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de compuestos, la producción de compuestos coloreados. Aun bacterias fuertemente relacionadas pueden separase en dos especies diferentes con base a pruebas bioquímicas.

Por ejemplo las bacterias entericas Gram – forman un grupo grande y heterogéneo. Esta familia Enterobacteriaceae incluye a varios patógenos que causan sindromes diarreicos. Los géneros clinicamente más importantes son: Escherichia, Salmonella, Shigella, Citrobacter y Enterobacter. El género Escherichia, Enterobacter y Citrobacter, fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a diferencia de los géneros Salmonella y Shigella que no fermentan la lactosa.

Demostración de la producción de Indol Aquí se empleó dos tubos con triptona y se inoculó los microorganismos Salmonella y Staphylococcus Aureus y se dejó incubado a 37 ºC por 24 horas y después a temperatura ambiente por 7 días. El tubo de S. Aureus dio positivo con color a rojo cereza, esto indica que este tipo de microorganismo es capaz de degradar al aminoácido tritófano formando un producto de hidrólisis de Indol. Bioquímicamente la Salmonella se caracteriza por no fermentar la lactosa y por no licuar la gelatina y por no producir Indol, aunque existen algunas excepciones. No todos los microorganismos pueden realizar este rompimiento de triptona a indol, por lo cual esta reacción es de valor taxonómico. E. coli logró degradar la triptona y reaccionar para producir Indol, es decir dio positiva la prueba, el microorganismo Gram - a pesar de que se le consideraba susceptible, en este medio reaccionan sin ningún problema.

Los sistemas comerciales más comúnmente usados son : * BBL, ENTEROTUBE II  (Becton Dickinson).  Es un sistema para usar en la identificación de Enterobacterias, definida como bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (-). Consiste en un tubo de plástico con 12 medios de cultivo contenidos en compartimentos individuales que se inoculan simultáneamente en una etapa y permiten la detección de 15 características bioquímicas. * OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson).  Es un sistema listo para usar para la identificación de bastones gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (+). Consiste en un tubo de plástico de 12 medios de cultivo que permite la realización simultánea de 14 pruebas bioquímicas. * API 20 E.  Es un sistema estandarizado para la identificación de Bacterias Gram -. Consiste en una plantilla con microtubos conteniendo medios de cultivo deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensión bacteriana. Permite la realización de 23 pruebas bioquímicas a partir de una única colonia bacteriana.

Producción Alcohólica de Levadura En la levadura que realiza una fermentación alcohólica, como es el caso de cepas en tubo de ensayo “pasteurizado” produjo mayor fermentación ya que al someterlo al calor se inhibe el crecimiento bacteriano que no son de nuestro interés y al inocular levadura esta se desarrolla sin ninguna dificultad; lo que ocurrió en el tubo rotulado, no pasteurizado ya que aunque crecieran levaduras y la fermentación no fue completa, ya que parte de la glucosa allí existente fue consumida por los demás microorganismos.

Producción de H2S por los microorganismos Aquí se inoculó los microorganismos E. coli y Salmonella en un tubo de ensayo cada uno con agar inclinado. En el primer tubo con E. Coli no cambio color, dio negativo, no reacciono con el azufre o no es capaz de producir ácido sulfhídrico en un medio de aminoácido que contenga azufre, el microorganismos no se desarrolla en medio de O2 en este caso. Mientras que la salmonella si desarrolló (en este medio con aminoácido) (H2S), esta prueba dio positivo. También hubo presencia del gas en medio del agar, este gas demuestra la presencia de (H2S). También el ennegrecimiento en la línea de siembra, nos indica que hubo producción de ácido sulfhídrico

MÉTODOS BASADOS EN DETECCIÓN MOLECULAR A través de procedimientos y reactivos, se pueden detectar determinadas secuencias de ADN que son propias de un determinado agente microbiano. PCR se aplica generalmente para la identificación de µorganismos que no pueden ser cultivados por métodos convencionales

Separación de las cadenas de ADN, ello se realiza aumentando la temperatura, la cual rompe los enlaces de H que mantiene unidos a las cadenas de ADN. 2. Adición de cadenas cortas de polinucleótidos, denominados cebadores que se unen por complementariedad de bases a cada una de las cadenas del fragmento de ADN que se desea amplificar, uno se une a la cadena 5’-3’ y otro a la cadena 3’-5’. 3. Disminución de la temperatura para permitir que los cebadores hibridicen con las cadenas de ADN de la muestra problema por complementariedad de bases. 4. Adición del ADN polimerasa, los cuatro nucleótidos y cofactores, para que tenga lugar la síntesis de la cadena complementaria.

ejemplos Bacterias Vibrio cholerae, helicobacter pylori, Staphylococcus aureus. Shigella dysenteriae, Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis. Virus: Parvovirus, Rotavirus, Adenovirus Rhinovirus. Protozoarios: Toxoplasma gondii, entamoeba histolyticum, Tripanosoma cruzi.

Otro método se fundamenta en la complementariedad de bases de ácidos nucleicos. Son aquellos que utilizan sondas de ADN, que se define como secuencias de oligonucleotidos de ADN marcados, con un elemento radioactivo (32P, 125I, 35S)con una proteína unida a una enzima como la fosfatasa alcalina. Estas sondas se utilizan para la detección de una secuencia complementaria de ADN o ARN, presente en el agente que se desea identificar.

MÉTODOS BASADOS EN PRUEBAS SEROLÓGICAS. Implican la utilización de preparaciones de inmunoglobulinas específicas provenientes de suero o de un reactivo y que pueden ser de gran utilidad en la identificación microbiana en muestras puras o muestras biológicas. Cada uno tiene un fundamento particular, pero en líneas generales todos se basan en la reacción de un antígeno presente en el agente microbiano con su anticuerpo correspondiente. Los serotipos permiten diferenciar organismos a nivel de subespecie, algo de gran importancia en epidemiología.

Inmunofluorescencia puede utilizarse para la identificación del µorganismo aislado o presente en una muestra biológica. En el método directo se fija la muestra problema a una lamina y se pone en contacto con el antisuero específico marcado con una sustancia fluorescente (rodamina o fluoresceína) transcurrido el tiempo para que tenga lugar la reacción antígeno anticuerpo se expone la lamina a la radiación ultravioleta para visualizar la reacción .

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Asssay" por sus siglas en inglés que significan Ensayo Inmuno Enzimático Absorbente. Estudio inmunológico de laboratorio por medio de reactivos para detectar diversos gérmenes, tales como virus o protozoarios. Se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectofotométricamente    

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes : Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.

Esta prueba se utiliza ampliamente en los laboratorios clínicos y le permite al médico: Analizar la sangre del paciente con un antígeno (ej., virus o bacterias) para ver si su sistema inmunológico lo reconoce como algo que ha visto antes. Analizar la sangre del paciente para ver si una sustancia particular como una hormona (un antígeno) está presente en su organismo.