IDENTIFICACIÓN DE LAS PRIMERAS MUTACIONES FUNDADORAS DEL GEN MLH1 EN POBLACIÓN ESPAÑOLA Marta Pineda Riu Barcelona, 21 de octubre de 2009

Análisis mutacional de genes reparadores en línea germinal c.306+5G>A y c.1865T>A del gen MLH1 son mutaciones frecuentes Historia personal o familiar sugestiva de síndrome de Lynch (Instituto Catalán de Oncología, 2000-2007) Análisis mutacional de genes reparadores en línea germinal 83 familias portadoras de alteraciones en genes reparadores → 45 familias portadoras de alteraciones en MLH1 Variante c.306+5G>A c.1865T>A Total Nº familias ICO 9 4 13 % familias MLH1(+) 20% 9% 29% % familias MMR(+) 11% 5% 16% El análisis mutacional de genes reparadores en pacientes con historia familiar o personal de síndrome de Lynch del ICO permitió la identificación de 83 familias portadoras de alteraciones germinales en los genes MMR, de las cuales 45 presentaban alteraciones en el gen MLH1. Entre ellas nos llamó la atención la presencia de 2 variantes frecuentes: c.306+5G>A y c.1865T>A, presentes en 9 y 4 familias respectivamente. En conjunto representaban el 29% de las familias con alteraciones detectadas en MLH1 y el 16% del total de familias con alteraciones en los genes reparadores. Estos cambios, a pesar de que habían sido previamente descritos en familias con sospecha de síndrome de Lynch, se consideraron variantes de significado desconocido, puesto que no eran mutaciones claramente truncantes y no se habían realizado estudios funcionales. La colaboración con otros centros españoles permitió la identificación de un total de 17 y 12 familias portadoras de dichas variantes. No se detectó relación de parentesco entre estas familias. Las variantes identificadas no se detectaban en población control ni de CCR esporádico. Estudio colaborativo: Total nº familias 17 12 29 Frec. controles 0/280 0/288 Frec. casos CCR 0/312 0/310 2

Las familias portadoras presentan características de síndrome de Lynch c.306+5G>A c.1865T>A Total nº familias 17 12 % familias Amsterdam 47% 67% Nº portadores afectos 27 20 % Tumores s. Lynch / total 94% (34/36) 92% (22/24) % CCR / total 83% (30/36) 75% (18/24) Mediana de edad al diagnóstico (rango) 50.0 años (20-80) 45.5 años (24-79) Cosegregación Sí Características tumores IMS / Pérdida MLH1 De las familias identificadas, una proporción importante cumplían criterios de Amsterdam. En individuos portadores, la mayoría de los tumores identificados eran del espectro de síndrome de Lynch, con una elevada proporción de tumores colorectales. La edad mediana al diagnóstico de cáncer era de 50 y 45 años respectivamente. Ambas variantes cosegregaban con la enfermedad en las familias identificadas. Los tumores CCR y de endometrio analizados presentaban inestabilidad de microsatélites y pérdida de expresión de MLH1, siendo compatible con la existencia de una mutación germinal en MLH1.

Las variantes del gen MLH1 identificadas son patogénicas c.306+5G>A MSH2 MSH6 c.1865T>A (p.L622H) Células HCT116: CHX Con la finalidad de determinar si las variantes identificadas eran patogénicas se realizaron diferentes ensayos para determinar su impacto funcional: La variante c.306+5 se localiza en el sitio donador de splicing del mRNA del intrón 3 de MLH1. El estudio por RT-PCR en RNA de linfocitos de individuos portadores de la mutación determinó que la mutación genera 2 tránscritos anómalos: uno, muy similar en tamaño al tránscrito salvaje y otro de menor tamaño. La secuenciación de esta doble banda correspondía al trascrito wt y otro con una deleción de 5pb, que se predice que genera una proteína truncada. La secuenciación de la banda menor correspondía al tráscrito con skipping del exón 3, que observábamos con menor intensidad en individuos control. Por lo tanto, la variante c.306+5G>A afecta el correcto splicing del mRNA.   Por otro lado, la variante c.1865T>A se localiza en el exón 16 del gen MLH1. Estudios de RNA no demostraron efectos sobre el splicing. Este cambio se predice que genera la mutación p.Leu622His, que afecta un residuo altamente conservado en el dominio de unión a PMS2. Con la finalidad de estudiar el impacto de esta mutación a nivel de proteína se transfectaron células HCT116, deficientes en MLH1: En estas células, la variante L622H presentaba menor expresión que MLH1 a distintos tiempos. Asimismo, los niveles de expresión de la proteína PMS2, que se estabiliza por la presencia de MLH1, también se veían disminuídos. Para determinar si el cambio p.L622H afectaba la estabilidad de la proteína se trataron las células con ciloheximida, que inhibe la síntesis de proteínas de novo. La disminución de la expresión de MLH1 debido al tratamiento es mayor en las células transfectadas con L622H que en las transfectadas con MLH1 salvaje, indicando que la proteína L622H es menos estable que la proteína salvaje. Estos resultados, junto con los previamente expuestos (como la presencia de cosegregación, la ausencia en controles y las características clinicopatológicas) confirman la patogenicidad de estas variantes. CHX

Diferencias en la penetrancia de las mutaciones identificadas Edad Cáncer Colorrectal (Hombres) Cáncer Colorrectal (Mujeres) Riesgo Acumulado Población (%) % Riesgo Acumulado Portadores (95% IC) Población (%) c.306+5G>A c.1865T>A 20 30 0.01 0.08 0.02 0.04 40 0.06 0.47 0.14 0.51 0.27 50 0.28 2.20 0.68 0.24 2.02 1.07 60 1.00 7.65 2.40 0.72 5.95 3.18 70 2.87 20.60 (1.35-36.74) 6.80 (0-15.80) 1.67 13.32 (1.03-24.08) 7.26 (0-16.50) Hazard Ratio (95% IC) Edad Cáncer Colorrectal (Hombres) Cáncer Colorrectal (Mujeres) c.306+5G>A c.1865T>A 20-49 14.65 (2.82-76.00) 4.10 (0.18-95.72) 12.03 (2.44-59.39) 9.56 (1.33-68.44) 50-69 5.89 (1.69-20.59) 1.89 (0.325-10.95) 6.73 (1.92-23.52) 1 (NA) Overall Hazard Ratio 7.92 (2.96-21.20) 2.42 (0.57-10.23) 8.49 (3.36-21.46) 4.48 (1.11-18.01) Realizamos una estimación de la penetrancia de las variantes identificadas: Se muestran aquí los riesgos acumulado de CCR en hombres y mujeres portadores de las mutaciones: El riesgo de CCR en portadores es superior al de la población general. A 70 años se estima entre 20 y 7% (dependiendo de la variante y el género del individuo). El overall HR (tasa de riesgo) se ha estimado entre 3 y 8. Es importante destacar que el número de familias incluídas es pequeño para un análisis de penetrancia. A pesar de ello, los resultados obtenidos sugieren que estas variantes presentan una penetrancia menor a la previamente reportada para mutaciones en MLH1.

Las familias portadoras presentan orígenes geográficos comunes Familias c.306+5G>A Familias c.1865T>A - D3S1612 34,56 - D3S1609 29,91 - D3S1298 38,02 - D3S3564 42,39 MLH1 Tel Cen Mb Cr3 - rs4234259 37,02 - D3S3623 37,41 - D3S2369 36,47 - rs1799977 37,03 - D3S1611 37,04 - rs9876116 37,06 A pesar de que los índices de las familias analizadas se habían identificado en las provincias rayadas en verde, los antepasados de las familias portadoras de la mutación c.306+5G>A proceden del norte de la península, de un área que coincide con el valle del Ebro, mientras que los ancestros de c.1865T>A precedían de la provincia de Jaén. La elevada frecuencia de estas mutaciones en nuestra serie y el origen geográfico común sugerían que podía tratarse por tanto de mutaciones fundadoras, es decir, cada mutación se habría dado en un único individuo fundador los descendientes del cual habrían permanecido relativamente aislados. Para evaluar esta hipótesis realizamos análisis de haplotipos asociado a las mutaciones, mediante el estudio de los marcadores intragénicos y extragénicos a MLH1 que se muestran.

c.306+5G>A y c.1865T>A del gen MLH1 son mutaciones fundadoras Edad estimada: 75 generaciones (53-122) MAX 1.55 Mb MIN 0.4 Mb 103 A G 256 - 224 199 D3S1609 (29,915) D3S1612 (34,565) D3S2369 (36,472) c.306+5G>A (37,018) rs4234259 (37,024) rs1799977 (37,029) D3S1611 (37,044) rs9876116 (37,059) c.1865T>A (37,064) D3S3623 (37,419) D3S1298 (38,024) D3S3564 (42,394) 104 101 - G 256 A 222 205 El análisis de estos marcadores reveló un haplotipo común para las 17 familias con la mutación c.306+5G>A, que comprendía entre 0.4 y 1.5Mb La estimación de la edad de la mutación basada en la longitud del haplotipo compartido y el número de recombinaciones ocurridas, determinó que la mutación había ocurrido hace 75 generaciones, es decir unos 1800 años. Hipotetizamos que la mutación ocurrió en el valle del Ebro y se distribuyó por la zona, debido al aislamiento de la cuenca y al hecho que el río fue navegable hasta el siglo 19.   También existía un haplotipo común para las 12 familias con la mutación c.1865T>A, de mayor tamaño, entre 0.95 y 3.46Mb. En este caso la edad estimada es de 15 generaciones, unos 400 años. La procedencia está restringida a la provincia de Jaén. Curiosamente actualmente estas familias hemos identificado en Madrid y Barcelona, que fueron destinos frecuentes de migraciones internas durante los años 60-70. MAX 3.46 Mb MIN 0.95 Mb c.1865T>A Edad estimada: 15 generaciones (12-22)

Conclusiones Hemos demostrado la patogenicidad y el efecto fundador de las mutaciones c.306+5G>A y c.1865T>A del gen MLH1, que representan las primeras mutaciones fundadoras en este gen identificadas en España. Los resultados obtenidos deberían considerarse en el diseño de las estrategias de diagnóstico molecular de síndrome de Lynch en nuestra población. Agradecimientos: I. Blanco, A.Teulé y J. Brunet, ICO, Cataluña T. Caldés, H. San Carlos, Madrid M. Urioste, CNIO, Madrid C. Martínez-Bouzas, H. de Cruces, Vizcaya J. Balmaña, H. Vall d’Hebron, Barcelona A. Torres, H. Sant Joan, Reus T. Ramón y Cajal, H. Sant Pau, Barcelona J. Sanz, C. Corachan, Barcelona L. Pérez-Cabornero, IBGM, Valladolid S. Castellví, H. Clínic, Barcelona E. Borràs, S. González, C. Lázaro, G. Capellá Laboratorio de Investigación Translacional, ICO Como Conclusiones de este trabajo podemos decir... Este trabajo ha sido posible gracias a la colaboración de muchas personas. Quisiera destacar la colaboración con las personas responsables de las familias incluídas en este estudio, nuestros colaboradores en la Universidad de Michigan y los miembros del Laboratorio de Investigación Translacional del ICO. Muchas gracias. N. Rosenberg, B. Mukherjee, S. Gruber University of Michigan