Inmunologia – Curso 2008 CITOMETRIA DE FLUJO

COMPONENTES DEL EQUIPO SISTEMA ÓPTICO SISTEMA FLUÍDICO COMPONENTES DEL EQUIPO SISTEMA ÓPTICO SISTEMA ELECTRÓNICO SISTEMA FLUÍDICO Permite la toma de la muestra y el traslado de las células para su análisis. SISTEMA ÓPTICO Para la generación y medición de las señales lumínicas. SISTEMA ELECTRÓNICO Convierte las señales ópticas en señales digitales para su análisis en la computadora. Debe lograr organizar las células en suspensión en fila india y transportarlas a través de la celda de flujo donde impactan con el haz de luz. El buffer de flujo (sheath fluid) circula a presión por todo el sistema de tubuladuras, la muestra se inyecta a través de un pequeño orificio produciendo un Flujo laminar. La muestra fluye en el eje central y no se mezcla con el sheath fluid. Es una técnica que permite la medición simultánea de múltiples características de partículas en un flujo líquido. Las células y/o partículas deben estar aisladas y en suspensión en un medio líquido. Se utilizan anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos para la marcación de proteínas específicas de cada célula ( análisis de poblaciones celulares) Colorantes específicos para determinación de mortalidad, proliferación, flujo de calcio, etc. Citometría de Flujo

Citometría de Flujo

PARÁMETROS CELULARES MEDIDOS El tamaño celular relativo ( Forward Scatter o FSC) La complejidad interna o granularidad relativa (Side Scatter o SSC) Intensidades relativas de emisión de fluorescencia ( FL1, FL2, FL3 ,FL4…..etc..) Citometría de Flujo

FORWARD SCATER – LUZ DIFRACTADA - SE RELACIONA CON LA SUPERFICIE Y AREA CELULARES -SE DETECTA EN EL EJE DE INCIDENCIA DEL LASER SIDE SCATER – LUZ REFLEJADA Y REFRACTADA -SE RELACIONA CON LA COMPLEJIDAD INTERNA DE LA CELULA Y SU GRANULARIDAD -SE DETECTA EN UN ANGULO DE 90 GRADOS CON EL HAZ DEL LASER Citometría de Flujo

MARCACION DE CELULAS CON ANTICUERPOS FLUORESCENTES Se utilizan, generalmente, inmunoglobulinas monoclonales contra antígenos de la supercicie de las celulas, marcadas con colorantes fluorescentes. Control negativo: Anticuerpo del mismo isotipo marcado con el mismo fluorocromo pero que no reconoce ninguna de las moléculas de la superficie. Control negativo: células que no fueron marcadas para determinar autofluorescencia. Control positivo: células normales, células de líneas celulares. Citometría de Flujo

Fluorocromos utilizados Citometría de Flujo

Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras: 1) Histograma ANALISIS DE DATOS Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras: 1) Histograma Eventos medidos Los datos colectados por el citometro los podemos analizar de 2 maneras: Histograma: Muestra cuantas celulas estan marcadas con cierto color, y las distintas intensidades de fluorescencia de cada una. Dot-plot: Muestra 2 valores a la vez, y cada punto representa una celula individual. Se dividen en general en los 4 cuadrantes. FLUORESCENCIA

HISTOGRAMA Citometría de Flujo En este grafico vemos el pico del control de isotipo (gris), que me marca lo que se considera que no hay marca. Y despues veo 2 poblaciones con distinta intensidad de fluorescencia. Citometría de Flujo

Intensidad de fluorescencia y sitios de unión FITC FITC FITC Número de eventos FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC Intensidad de fluorescencia FITC Citometría de Flujo

Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras: 2) Dot-plot Dot-plot: Muestra 2 valores a la vez, y cada punto representa una celula individual. Se dividen en general en los 4 cuadrantes. Citometría de Flujo

Analisis de datos Granulocitos Monocitos Linfocitos Aca vemos un resultado real. Vemos una muestra de sangre periferica, donde podemos reconocer las 3 subpoblaciones de leucocitos. Los GR y plaq son mas chicos. Las 3 poblaciones de leucocitos las reconozco mediante dot-plot de forward-scatter. Ademas esas celulas las marque con antiCD3 y anti CD4, y veo los histogramas de CD3 y CD4.

CD3 – CD4 en gate de linfocitos Elijo un gate: Ej. linfocitos CD3- CD4 en sangre total CD3 – CD4 en gate de linfocitos Aca vemos marca de CD3 y CD4. Queremos saber el porcentaje de CD3 y CD4 en sangre entera (ver porcentajes en cuadrantes) y en el gate de linfocitos.

Expresión de Resultados Datos porcentuales Datos absolutos : Partículas de cuantificación Datos estadísticos EL programa tambien nos provee datos de: -Porcentaje de celulas en el gate que yo elegi o en cada cuadrante -El promedio de fluorescencia de ese gate para la FL de X y para la de Y Citometría de Flujo

Separación de células usando citometría de flujo (Cell sorting) -El citómetro permite separar físicamente, poblaciones de células -Se puede realizar en condiciones de esterilidad. La separacion de las celulas de interes se realiza por aplicación de una carga electrica a las gotas. El equipo mira la celula y si esa gota tiene una celula de interes le agrega una carga. Esa gota cargada es deflectada por electrodos hacia el tubo de colección. Luego uno lo que hace es volver a pasar la muestra por el citometro, para determinar la pureza de la poblacion y su fluorescencia. Citometría de Flujo

Determinación de citoquinas intracelulares por citometría BD Biosciences Pharmingen recommends the use of an intracellular protein transport inhibitor during in vitro cell activation for intracellular cytokine staining. Use of BD GolgiStop™ (Cat. No. 554724; containing monensin) or BD GolgiPlug™ (Cat. No. 555029; containing brefeldin A) will block intracellular transport processes and result in the accumulation of most cytokine proteins in the endoplasmic reticulum/Golgi complex. This leads to an enhanced ability to detect cytokine-producing cells (see Figures 3 and 4

Podemos ver el dot-plot de un marcador de superficie (CD69) y de la citoquina intracelular.

DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO TUNEL: Determina ADN fragmentado, incorporando a los extremos de ADN 12-dUTP-FITC

DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO TUNEL: Determina ADN fragmentado, incorporando a los extremos de ADN 12-dUTP-FITC

DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO ANEXINA V Apoptosis is characterized by a variety of morphological features such as loss of membrane asymmetry and attachment, condensation of the cytoplasm and nucleus, and internucleosomal cleavage of DNA. One of the earliest indications of apoptosis is the translocation of the membrane phospholipid phosphatidylserine (PS) from the inner to the outer leaflet of the plasma membrane. Once exposed to the extracellular environment, binding sites on PS become available for Annexin V, a 35-36 kDa, Ca 2+-dependent, phospholipid binding protein with a high affinity for PS. The translocation of PS precedes other apoptotic processes such as loss of plasma membrane integrity, DNA fragmentation, and chromatin condensation. As such, Annexin V can be conjugated to biotin or to a fluorochrome such as FITC, PE, APC, Cy5, or Cy5.5, and used for the easy, flow cytometric identification of cells in the early stages of apoptosis. Tracking Cells Through Apoptosis Because PS translocation also occurs during necrosis, Annexin V is not an absolute marker of apoptosis. Therefore, it is often used in conjunction with vital dyes such as 7-amino-actinomysin (7-AAD) or propidium iodide (PI), which bind to nucleic acids, but can only penetrate the plasma membrane when membrane integrity is breached, as occurs in the later stages of apoptosis or in necrosis. No Apoptosis = Cell Viability Cells that are negative for both Annexin V and the vital dye have no indications of apoptosis: PS translocation has not occurred and the plasma membrane is still intact. Early Apoptosis Cells that are Annexin V-positive and vital dye-negative, however, are in early apoptosis as PS translocation has occurred, yet the plasma membrane is still intact. Late Apoptosis or Cell Death Cells that are positive for both Annexin V and the vital dye are either in the late stages of apoptosis or are already dead, as PS translocation has occurred and the loss of plasma membrane integrity is observed. When measured over time, Annexin V and a vital dye can be used to monitor the progression of apoptosis: from cell viability, to early-stage apoptosis, and finally to late-stage apoptosis and cell death.

DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO IODURO DE PROPIDIO

PROLIFERACION CELULAR: CFSE Carboxifluorescein diacetato succinimidil ester (CFSE) - Sonda fluorescente que se une a proteínas intracelulares y que se reparte por igual entre las células hijas CFSE passively diffuses into cells. It is colorless and nonfluorescent until the acetate groups are cleaved by intracellular esterases to yield highly fluorescent carboxyfluorescein succinimidyl ester. The succinimidyl ester group reacts with intracellular amines, forming fluorescent conjugates that are well retained and can be fixed with aldehyde fixatives. Excess unconjugated reagent and by-products passively diffuse to the extracellular medium, where they can be washed away. The dye–protein adducts that form in labeled cells are retained by the cells throughout development and meiosis, and can be used for in vivo tracing.1 The label is inherited by daughter cells after either cell division (Figure 2) or cell fusion, and is not transferred to adjacent cells in a population.2-4 Lymphocytes labeled with CFSE have been detected up to eight weeks after injection into mice in lymphocyte-migration studies,5 and viable hepatocytes that were similarly labeled were easily located by fluorescence microscopy even 20 days after intrahepatic transplantation.

Basal Después del cultivo CFSE Fluorescencia / célula X X / 2 X / 4 Se observan los picos que representan las distintas generaciones de celulasprovenientes de la proliferacion de las celulas parentales.

Cytometric bead arrays (CBA) Varios analitos Tonos de un color Ac. unidos a beads, emitiendo a distintas intesidades de FL3 Ac conjugados con PE (emitiendo en FL2), proporcionales a la conc del analito. Multiplex ensayo por CF Citoquinas – Determinación de citoquinas secretadas por citometría

CBA para citoquinas inflamatorias IL-6 IL-10 MCP-1 IFN-g TNF-a IL-12 PBS CBE FL-3 FL-3 FL-2 FL-2 FL-2: Da cuenta de la concentración de la citoquina. FL-3: Da cuenta de las diferentes citoquinas. Citoquinas – Determinación de citoquinas secretadas por citometría