TENDENCIAS EN CITOMETRÍA DE FLUJO

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1 TENDENCIAS EN CITOMETRÍA DE FLUJO

2 TENDENCIAS EN CITOMETRÍA DE FLUJO
Cuantificación del número de moléculas por célula Determinación de moléculas solubles Enumeración celular Nuevas formas de marcaje 4.1 Marcaje de receptores con ligandos fluorescentes 4.2 Marcaje intracelular 4.3 Marcaje de proteínas totales

3 1) CUANTIFICACIÓN DEL NÚMERO DE MOLÉCULAS POR CÉLULA INDIVIDUAL

4 Cuantificación del número de moléculas por célula individual
Cuantificación del número medio de moléculas por célula La cantidad de antígeno que contiene cada célula se expresa en ABC (antigen binding capacity) o capacidad de unión antigénica

5 CUANTIFICACIÓN DE ABC 1.1) QUIFIKIT 1.2) RAINBOW BEADS

6 1.1) QUIFIKIT: FUNDAMENTO
Micropartículas de calibración con cantidades determinadas de IgG unidas. Se emplea un segundo anticuerpo fluorescente anti-IgG. La fluorescencia por micropartícula es proporcional a la cantidad de IgG unida Se realiza una curva de calibración entre la intensidad media de fluorescencia frente a la capacidad de unión de anticuerpo (ABC)

7 PROTOCOLO DE MARCAJE

8 PROTOCOLO DE MARCAJE

9 QUIFIKIT

10 QUIFIKIT

11 REALIZACIÓN DE LA RECTA ESTÁNDAR
Unión media bruta (ABC media bruta) relaciona la intensidad de fluorescencia con la capacidad de unión Se obtiene la formula de la recta que nos permitirá deducir la ABC media bruta de cada célula a partir de su intensidad de fluorescencia media

12 RECTA DE REGRESIÓN fluorescence intensity) log MFI (mean
log ABC (antigenic binding capacity) 3 4 5 6 fluorescence intensity) log MFI (mean 1 2 voltage 453 (r2=0.999) voltage 463 (r2=0.999) voltage 473 (r2=1) voltage 483 (r2=0.999) voltage 493 (r2=0.999)

13 1.2) RAINBOW BEADS Micropartículas con número conocido de moléculas de fluorocromos unidos covalentemente

14 RAINBOW BEADS Patrón Problema

15 RAINBOW BEADS

16

17 CÁLCULO DE LA DENSIDAD ANTIGÉNICA POR CÉLULA
Asunción: el control negativo tiene cero moléculas del antígeno Problema: emite fluorescencia inespecífica Hay que tener en cuenta el número de fluorocromos por anticuerpo

18 CÁLCULO DE LA DENSIDAD ANTIGÉNICA POR CÉLULA
La capacidad de unión específica (ABC específica o neta) es igual a la cantidad de moléculas antigénicas expresadas por cada célula. Experimentalmente se determina como la ABC media para el anticuerpo específico menos la ABC media del control negativo

19 DIFERENCIACIÓN DE POBLACIONES EN BASE A UNA DETERMINADA MOLÉCULA
En linfocitos CD4 activados disminuye la intensidad de expresión del correceptor CD4. En linfocitos CD8 activados aumenta la expresión del correceptor CD8 Activación TCR modulación de CD3 La apoptosis reduce la expresión de determinados antígenos de linaje

20 2) CUANTIFICACIÓN DE CONCENTRACIONES DE MOLÉCULAS SOLUBLES

21 FUNDAMENTO El numero medio de moléculas de citocina capturadas por cada partícula se relaciona con la concentración de la citocina en el sobrenadante

22 PROTOCOLO Incubación Lavado Marcaje Lavado

23 DETERMINACIÓN DE CITOCINAS SOLUBLES
- + SSC Citocina - +

24 CUANTIFICACIÓN DE CONCENTRACIONES DE MOLÉCULAS SOLUBLES
Más rápido y sensible que el ELISA. 90 min. Sensibilidad fentomolar: M Multiparamétrico

25 3) ENUMERACIÓN CELULAR

26 ENUMERACIÓN CELULAR Los métodos anteriores proporcionaban una cifra relativa de las células que están proliferando - Este método ratiométrico permite calcular el número absoluto de células con respecto a las que sembramos inicialmente

27 CULTIVOS CELULARES Células PHA Medio

28 ENUMERACIÓN CELULAR R1 Crecimiento R2 Basal R1 R1 Muerte R2 R2 celular
Tras cultivo CÉLULAS T CÉLULAS B MICROPARTÍCULAS R1 Crecimiento R2 Basal R1 R1 Muerte celular R2 R2

29 ENUMERACIÓN CELULAR Crecimiento Tras Cultivo Apoptosis

30 CÁLCULO DEL NÚMERO ABSOLUTO DE CÉLULAS
N0 = concentración celular inicial Nt = concentración celular a tiempo t Nt = (Ratiot / Ratio0) * N0 Ratiot = (Célst / Partículast) Ratio0 = (Céls0 / Partículas0)  t. Partículas = cte. Nt = (Célst / Céls0) * N0

31 ENUMERACIÓN CELULAR Basal 4000 2000 = 2 Crecimiento 1 50.000 céls 2 x
= 2 Crecimiento céls x = x = céls Apoptosis 1000 2000 = 0.5 Células Partículas = = 1 céls x = 2000 = céls x = céls

32 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ENUMERACIÓN CELULAR
Centrifugación Sedimentación de células y micropartículas Número de células y de micropartículas adquiridas

33 CENTRIFUGACIÓN CELULAR
Número de lavados 1 2 3 % de recuperación celular 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 300 g 200 g

34 SEDIMENTACIÓN DE CÉLULAS Y MICROPARTÍCULAS
Ratio Céls/Micropartículas 0.0 .2 .4 .6 .8 1.Adquiridas inmediatamente Tras 20 minutos: 2. Adquirir 3. Agitación manual. 4. Vortex *

35 NÚMERO DE CÉLULAS Y MICROPARTÍCULAS ADQUIRIDAS
Ratio células/partículas 0.1 1 10 2 4 6 8 12 14 100 CV del ratio

36 VALIDACIÓN DEL MÉTODO Precisión Sensibilidad Exactitud
Coeficiente de variación (CV) Sensibilidad Límite de sensibilidad Exactitud Linealidad

37 ESTUDIO DE LA PRECISIÓN Y DE LA SENSIBILIDAD
Contadores celulares Células/ml x 10-3 1 10 100 1000 CV (%) 20 30 40 50 60 Microscopía Citometría de flujo

38 ESTUDIO DE LA EXACTITUD
Microscopía Contadores celulares Citometría De flujo Ratio céls/micropart 2 4 6 8 10 200 400 600 800 1000 r= Nº absoluto de células x 10-3 Nº medio de células por campo 10 20 30 40 50 60 70 r = Nº medio de células x 10-3 200 400 600 800 1000 r=

39 ENUMERACIÓN DE CÉLULAS APOPTÓTICAS
Las células apoptóticas se fragmentan en cuerpos apoptóticos Las células apoptóticas pierden la expresión de antígenos específicos de linaje.

40 FRAGMENTACIÓN CELULAR
Una célula apoptótica se fragmenta en varios cuerpos apoptóticos. ¿Cuál es el límite en FSC entre las células apoptóticas y los cuerpos apoptóticos?

41 Permeabilidad de membrana
FRAGMENTACIÓN CELULAR Permeabilidad de membrana Tamaño celular Aunque se pudiera precisar el límite, perdemos células ya fragmentadas que escapan del gate de análisis.

42 INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS
Prevalencia = apoptóticas /viables+apoptóticas = (1/5) 20% = prevalencia de la apoptosis Incidencia = (apoptóticas + fragmentadas+ pérdidaAg) / total = (6/10) 60% = incidencia de la apoptosis

43 INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS
(1/10) = 10 % prevalencia Incidencia = (1/10) 10%

44 APOPTOSIS TEMPRANA (4/9) = 44% prevalencia Incidencia (5/10) = 50%

45 APOPTOSIS TARDÍA Fragmentación celular Incidencia = 60% (1/5) =
20 % prevalencia Fragmentación celular Cuerpos apoptóticos

46 IMPACTO DE LA FRAGMENTACIÓN CELULAR EN LA MEDIDA DE LA APOPTOSIS
0 hours 6 hours 24 hours

47 PÉRDIDA DE ANTÍGENOS ESPECÍFICOS DE LINAJE (AEL)
Si las células apoptóticas pierden su AEL, la prevalencia de la apoptosis en la población positiva será menor que su incidencia en la población original

48 APOPTOSIS INDUCIDA POR CICLOHEXIMIDA
CD3 CD8 CD4 CD19 20 40 60 80 100 AI TOTAL AI HIGH AI MED AI LOW Porcentaje de células apoptóticas ALL BRIGHT DIM NEG AEL

49 CD19 on B-CLL leukemic cells
Estudio de la expresión de AEL en células en diferentes estadios de la apoptosis CD19 on B-CLL leukemic cells Apoptóticas tardías MFI 004 Apoptóticas intermedias MFI 015 Apotóticas tempranas MFI 061 MFI 131 Células viables

50 MFI PÉRDIDA DE LA INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA
DE ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LINAJE (CD19) POR CÉLULA INDIVIDUAL Viable cells Early Apoptotic Intermediate Late MFI 20 40 60 80 100 120 140 ESTADIO DE LA APOPTOSIS

51 PÉRDIDA DE LA INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA
DE ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LINAJE (CD8 Y CD56) POR CÉLULA INDIVIDUAL

52 PÉRDIDA DE LA INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA
DE ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LINAJE (CD3 Y CD5) POR CÉLULA INDIVIDUAL

53 PORCENTAJE DE PÉRDIDA DE AEL ENTRE LAS CÉLULAS VIABLES Y LAS APOPTÓTICAS TEMPRANAS (EA)

54 REPERCUSIÓN EN LA INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS DE LA FRAGMENTACIÓN CELULAR Y DE LA PÉRDIDA ANTIGÉNICA
APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS ___________________________________________________________ VIABLES + APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS ≤ APOPTÓTICAS _________________________________ AI = VIABLES + APOPTÓTICAS

55 APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS
REPERCUSIÓN EN LA INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS DE LA FRAGMENTACIÓN CELULAR Y DE LA PÉRDIDA ANTIGÉNICA APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS VIABLES + APOPTÓTICAS VIABLES + APOPTÓTICAS ≤ 2 = 0.25 < = 0.5 6 + 2

56 Subpoblación linfocitaria % de células apoptóticas
AR vs. AI Subpoblación linfocitaria CD19 CD56 CD8 CD4 CD3 % de células apoptóticas 20 40 60 80 100 AI AR

57 4) NUEVOS MÉTODOS DE MARCAJE

58 4) NUEVOS MÉTODOS DE MARCAJE
4.1 Marcaje de receptores con ligandos fluorescentes 4.2 Marcajes intracelulares 4.3 Marcajes de proteínas totales

59 4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES

60 4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES
Estudio de receptores con ligandos solubles (citocinas, factores de crecimiento). Para medir la capacidad de unión de ligando por célula individual. Se emplean ligandos marcados con moléculas fluorescentes Buffer de marcaje especiales optimas para unión del ligando a su receptor específico

61 4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES
Ligando-FITC

62 4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES
Ligando-FITC Ligando Receptores unidos a ligando frío no son reconocidos marcaje en ausencia de ligando frío. Choque pH, PBS sin suero.

63 4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES
Ligando-FITC Dominio de unión Receptores unidos a ligando frío no son reconocidos marcaje en ausencia de ligando frío. Choque osmótico, PBS sin suero.

64 4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES
Ligando-FITC Unión inespecífica Receptores unidos a ligando frío no son reconocidos marcaje en ausencia de ligando frío. Choque osmótico, PBS sin suero.

65 4.2) MARCAJE DE MOLÉCULAS INTRACELULARES

66 4.2) MARCAJE DE MOLÉCULAS INTRACELULARES
Mitocondriales (Bcl-2, Apo-2) de gránulos de secreción (citocinas, perforinas, granzimas) Detección de receptores presentes en citoplasma pero no expresados en superficie Caracterización multiparamétrica de las células que producen las citocinas en poblaciones de células mononucleares

67 4.2) MARCAJE DE MOLÉCULAS INTRACELULARES
Permite el estudio de gran número de células y realizar medidas estadísticamente significativas: → error = 33% 100 → error = 10% → error=1% Aporta información sobre producción de citocinas por células individuales caracterizadas por inmunofenotipo

68 LIMITACIONES DE LAS TÉCNICAS DE MARCAJE INTRACELULAR
Sensibilidad limitada: cantidad mínima de citocina detectable en cada célula frecuencia mínima de células positivas discriminable del fondo Para marcar intracelularmente hay que matar las células

69 SENSIBILIDAD

70 SOLUCIONES CANTIDAD MÍNIMA DE CITOCINA DETECTABLE EN CADA CÉLULA
Anticuerpos marcados con APC para aumentar la intensidad de fluorescencia media por célula Aumentar el número de fluorocromos por anticuerpo Inhibidores del transporte celular para aumentar las concentraciones intracelulares

71 FRECUENCIA DE CÉLULAS POSITIVAS DISCRIMINABLES
+S, -E -S, +E El segundo problema no tiene fácil solución podemos elevar los umbrales de positividad para aumentar la especificidad pero perdemos sensibilidad para detectar células positivas.

72 AMPLIFICACIÓN ENZIMÁTICA DEL MARCAJE INTRACELULAR
Se marcan las células con anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano (HRP) La HRP produce radicales inestables tiramina conjugados con biotina que se depositan alrededor del lugar de catálisis La adición de estreptavidina conjugada con HPR amplifica la señal Se incrementa 15 veces la relación señal-ruido

73 AMPLIFICACIÓN CATALÍTICA DEL MARCAJE INTRACELULAR (CARD)
HPR Biotina + Sustrato Radical tiramina Tiramina

74 AMPLIFICACIÓN CATALÍTICA DEL MARCAJE INTRACELULAR (CARD)
Estreptavidina-HPR +

75 EXPRESIÓN EN MEMBRANA DE CITOCINAS
IL-10 e IFNg se expresan en membrana plasmática en un número bajo de copias (<300 copias/membrana) Sistemas de amplificación Liposomas magneto-fluorescentes 1 x 105 IL IFNg

76 EXPRESIÓN EN MEMBRANA DE CITOCINAS
IL IFN

77 EXPRESIÓN EN MEMBRANA DE CITOCINAS
IL IFN

78 MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS
Uso de anticuerpos biespecificos anti-CD45-anti-citocina para la captura de las citocinas producidas por células individuales Se pueden fabricar también con fragmentos Fab

79 MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS
CD45 Anti-citocina Citocina

80 MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS
Permite la separación de las células viables productoras de una citocina determinada por FACS o por separación inmunomagnética Estas células se pueden analizar por otros métodos o cultivarse para obtener clones

81 4.3) MARCAJE DE PROTEÍNAS TOTALES

82 RELACIÓN ENTRE LA PROLIFERACIÓN CELULAR Y LA APOPTOSIS
Todas se dividen una vez 1 cél. apoptosis 1 se divide 3 veces Sembramos células recogemos ¿cuantas veces se han dividido?¿Como saber que células y cuanto han crecido? Ej. Superantígenos. ¿Cómo conocer la frecuencia de células respondedoras a un determinado antígeno? Proliferación ½ apoptosis ½ se dividen 2 veces

83 HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE
Carboxifluorescein diacetato succinimidil ester (CFSE) Sonda fluorescente que se une a proteínas intracelulares y que se reparte por igual entre las células hijas

84 HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE

85 HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE
Fluorescencia / célula X X / 2 X / 4

86 MARCAJE CON CFSE Después Basal del cultivo
But this will be the topic of another talk

87 CULTIVOS CELULARES Células PHA Medio

88 HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE No proliferantes Proliferantes

89 HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE

90 HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE
Combinación con antígenos de superficie: relación procesos de diferenciación con procesos de proliferación

91 3 días de cultivo 3% 59% PHA 38% 3% 53% PHA + IL-2 44%

92 5 días de cultivo 23% 48% PHA 29% 15% 48% PHA + IL-2 37%

93 7 días de cultivo 71% 19% PHA 10% PHA + IL-2 37% 40% 23%

94 MARCAJE CON CFSE Estudios in vivo Estudios ex vivo Estudios in vitro