LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC) CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)

Cromatografía líquida de alta eficiencia La fase móvil es líquida Partición o reparto Adsorción Intercambio iónico Exclusión molecular

Cromatografía líquida de alta eficiencia Características y ventajas Trabaja con partículas muy pequeñas (< 10 mm) Presiones de 1000 - 6000 psi (pounds square inch = libras por pulgada cuadrada, 1 atm = psi/14.7) Rápida Picos angostos (alta eficiencia) Separa compuestos no-volátiles o térmicamente inestables

Esquema del equipo de HPLC INYECTOR PRE-COLUMNA BOMBA CÁMARA DE MEZCLA COLUMNA DETECTOR

Elución isocrática vs elución con gradiente Elución isocrática: solvente de composición constante. Elución con gradiente: solventes de distinta polaridad. Se varía la composición de la FM en forma continua o escalonada. Elución con gradiente Elución isocrática

Solventes utilizados como FM Solventes orgánicos, agua/solventes miscibles, agua/soluciones reguladoras Alta pureza Desgasificados Tratamiento con He Sistema de desgasificación al vacío Filtración

Sistemas de bombeo Requerimientos Generación de altas presiones (1000 - 6000 psi) Flujo libre de pulsaciones Caudales 0.1 – 10 mL/min Componentes resistentes a la corrosión (acero inoxidable, teflón)

Bomba recíproca o de movimiento alternado etapa de aspiración etapa de descarga hacia la columna pistón fase móvil Ventajas: pequeño volumen interno, resiste presiones > a 10.000 psi, permite elución con gradiente, caudales constantes e independientes de la contrapresión de la columna y la viscosidad del solvente Desventaja: produce flujo pulsado (amortiguar)

Sistemas de inyección de muestra Llenado del bucle Inyección de muestra en columna muestra eluyente eluyente columna columna

Sistemas de inyección de muestra

Sistemas de inyección de muestra

Precolumna Composición similar a la columna cromatográfica Elimina materia en suspensión y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la FE Se usa para mejorar la vida de la columna. Se reemplaza cuando se contamina.

Columna Tubos de acero inoxidable. Ocasionalmente de vidrio resistente Rectas (10 - 30 cm de longitud) y 4-10 mm d.i. Tamaño partículas de relleno: 5–10 mm Columnas termostatizadas: en general se trabaja a T ambiente. La T constante mejora el cromatograma

Columna

Columna Rellenos Relleno pelicular. Esferas de vidrio o polímero no porosas de 30 – 40 mm de diámetro. En la superficie de las esferas se deposita una capa delgada y porosa de sílica, alúmina, polímero. Relleno de partículas. Micropartículas porosas de sílica, alúmina o polímero de 3 – 10 mm de diámetro. Se recubren con películas orgánicas que unen químicamente o físicamente a la superficie.

Detectores Basados en la medida de una propiedad del eluyente (índice de refracción, constante dieléctrica, densidad) Basados en la medida de una propiedad del soluto (absorbancia, fluorescencia, corriente límite) Requisitos Sensibilidad adecuada Respuesta lineal amplia Respuesta rápida y reproducible Manejo sencillo

Celda del detector UV-visible en HPLC De la columna Ventanas de cuarzo Fuente UV Detector Al desecho

Eficiencia de la columna Tamaño partículas de empaque Ensanchamiento extracolumna Tamaño de muestra

H vs m para partículas de diferentes diámetros 10 mm H 5 mm 3 mm m (cm/min)

Tamaño de muestra H mg muestra/ g empaque adsorción L-L (k = 2.3) De acuerdo al tipo de FE el efecto es más o menos pronunciado fase ligada (k = 4.3) fase ligada (k = 1.2)

pr2m Hex = 24 DM Ensanchamiento extracolumna Se origina en los tubos que conectan los componentes del sistema cromatográfico (puerto de inyección y columna, columna y detector, etc.) radio del tubo [cm] velocidad lineal de FM [cm/s] pr2m 24 DM Hex = coeficiente de difusión del soluto en fase móvil [cm2/s]

CROMATOGRAFÍA GASEOSA

Cromatografía gaseosa FM FE MÉTODO INTERACCIÓN líquida G-L y G-FL partición G-L Gaseosa sólida adsorción G-S

Cromatografía gaseosa Ventajas: Alta resolución Alta velocidad Alta sensibilidad Separación de compuestos con PE ~ Limitaciones: Muestras volátiles o fácilmente vaporizables Deficiente para compuestos iónicos o de PM > 600 Deficiente como técnica cualitativa y preparativa

Cromatógrafo de gases

Esquema de un cromatógrafo de gases cromatografía de elución sitio de referencia medidor flujo Detector puerto de inyección registro gas portador columna

Puerto de inyección septo de goma salida de purga del septo entrada gas portador salida de excedente Bloque de metal calentado cámara de vaporización vidrio columna

Columnas Columnas rellenas Columnas tubulares abiertas (capilares)

Columnas tubulares abiertas (capilares) Diámetro interno (100 a 700 mm) flujo poliimida Sílice fundida Soporte recubierto con FE líquida WCOT SCOT FSOT

Columnas FSOT WCOT SCOT Rellena

Fases estacionarias Nombre comercial Ejemplos de algunas fases estacionarias usadas en cromatografía de gases Fases estacionarias Nombre comercial Polidimetilsiloxano OV-1, SE-30 Poli(fenilmetildimetil)siloxano [10% fenil] OV-3, SE-52 Poli(fenilmetil)siloxano [50% fenil] OV-17 Poli(trifluoropropildimetil)siloxano OV-210 Polietilenglicol Carbowax 20M Poli(dicianoalildimetil)siloxano OV-275

CG de 10 compuestos en FE de distinta polaridad FE no-polar poli(dimetilsiloxano) 69 117 102 98 138 126 hexano butanol 3-pentanona heptano pentanol octano 5 6 7 8 9 10 80 metil etil cetona 4 97 propanol 3 36 pentano 2 56 acetona 1 PE (°C) Compuesto Los compuestos aparecen casi en orden creciente de sus puntos de ebullición. El determinante principal de la retención en esta columna es la volatilidad de los compuestos

CG de 10 compuestos en FE de distinta polaridad FE polar poli(etilenglicol) alcanos 69 117 102 98 138 126 hexano butanol 3-pentanona heptano pentanol octano 5 6 7 8 9 10 80 metil etil cetona 4 97 propanol 3 36 pentano 2 56 acetona 1 PE (°C) Compuesto cetonas propanol pentanol butanol La FE muy polar retiene los solutos polares. Los primeros que se eluyen son los 4 alcanos, le siguen las 3 cetonas y por último los 3 alcoholes. La fuerza determinante de la retención es el enlace de hidrógeno con la FE.

Efecto de la temperatura en el cromatograma Isotérmica a 45 °C Isotérmica a 145 °C Programada

Detector de conductividad térmica

Detector de ionización de llama (FID) terminal de la columna gas portador H2 aire llama electrodo colector

Detector de captura electrónica (Ni63, Sr90) aislante de la columna al desecho emisor radiactivo b + electrodo -

CONDUCTIVIDAD TÉRMICA IONIZACIÓN DE LLAMA CAPTURA ELECTRÓNICA COMPUESTOS Orgánicos e inorgánicos. Algunos dañan los filamentos (HCl, Cl2, haluros de alquilo) Orgánicos. No responde a CO, CO2, SO2, H2O Con átomos electronegat.(haluros de alquilo, organometálicos, organofosforados) GAS PORTADOR H2, He N2, He N2, Ar SENSIBILIDAD Moderada Muy buena LINEALIDAD Buena Amplia Limitada TEMPERATURA LÍMITE 400 °C 225 °C (Tr) 350 °C (63Ni) OTROS No destructivo. Afectado por variaciones de temperatura y caudal Destructivo, requiere 3 gases y electrómetro No destructivo, requiere licencia, muestras secas y electrómetro

Análisis cuantitativo en CL y CG Uso de patrones externo e interno S P S Uso de patrón externo Área S [S] [S]/[P] Área S Área P Área Sx Área Sx Área P Sx Sx P

CROMATOGRAFÍA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS Un espectrómetro de masas acoplado a un cromatógrafo líquido o a un cromatógrafo de gases es un potente detector para análisis cualitativo y cuantitativo La espectrometría de masas es una técnica basada en ionizar moléculas gaseosas, acelerarlas en un campo eléctrico y separarlas de acuerdo a sus masas Un espectro de masas es un gráfico que muestra la abundancia relativa de cada fragmento que llega al detector de un espectrómetro de masas