EFECTOS DE LA UREMIA Y LA CONCENTRACIÓN DE BICARBONATO EN LA CALCIFICACION DE LAS CÉLULAS DE MÚSCULO LISO VASCULAR Alain J. de Solís, Francisco R. González-Pacheco, Juan J.P. Deudero, Mª Angeles Castilla, Fernando Neria, Silvia Peñate, Ruth Fernández-Sánchez, Carlos Caramelo. Laboratorio de Nefrología e Hipertensión. Fundación Jiménez Díaz - Capio. Universidad Autónoma de Madrid.

CALCIFICACIÓN VASCULAR Proceso regulado, caracterizado por la deposición de cristales minerales en el tejido vascular, especialmente sobre arterias y válvulas cardiacas. Células endoteliales (CE) Células de músculo liso vascular (CMLV) Macrófagos, Fibroblastos Tipos celulares Moléculas Anticalcificantes: MGP, OPG, Fetuina–A Procalcificantes: ALP, Cbfa-1, Osteocalcina Tipos de calcificación vascular Asociada a CE y macrófagos. Relacionada con procesos inflamatorios y oxidativos asociados a ateroesclerosis. Localizada sobre la lámina elástica de CMLV. Similar a la esclerosis de Mönckeberg. Capa intima  Capa media 

La calcificación de la media arterial es un factor de riesgo cardiovascular particularmente significativo en los pacientes urémicos. Es un proceso activo, con transformación de las CMLV hacia un fenotipo osteoblástico. Ateroesclerosis Diabetes Hiperfosfatemia y/o hipercalcemia, con elevación del producto Ca X P Factores desconocidos Factores de riesgo La administración de bicarbonato para corregir la acidosis metabólica aumenta el pH sanguíneo. In vitro, el pH alcalino favorece la precipitación de los fosfatos cálcicos.

Fenotipo osteoblástico Modelo del cambio fenotípico de CMLV (Shanahan, Giachelli) CMLV Fenotipo osteoblástico CMLV Fenotipo normal Pi Daño celular Perdida inhibidores Apoptosis Hiperfosfatemia Hipercalcemia Cbfa-1 ALP Colágeno I Vesículas de matriz Ca X P Raggi P., ASN Renal Week 2004 Calcificación de la lamina elástica de las CMLV ARTERIOPATIA URÉMICA CON CALCIFICACIÓN DE LA MEDIA

HIPÓTESIS La alcalinización extracelular favorece la acumulación de calcio en el tejido vascular Este efecto es más intenso en el suero urémico OBJETIVOS Analizar el papel del suero urémico como potenciador de la calcificación vascular en un modelo in vitro Estudiar el efecto de la variación de pH extracelular y de las concentraciones de bicarbonato sobre la calcificación

MATERIALES Y MÉTODOS Cultivo primario de células de músculo liso vascular de aorta bovina. Inducción de calcificación mediante -glicerofosfato 10 mM. Variaciones en la concentración de bicarbonato y en el pH extracelular. Análisis del proceso de calcificación mediante: Visualización de la calcificación con tinción Von Kossa Medida de la incorporación de 45Ca Medida de la expresión de marcadores de transformación osteoblástica EIPA (n-ethylisopropylamiloride): inhibidor del intercambiador Na+/H+ PFA (Acido Fosforofórmico/Foscarnet): inhibidor del transportador P/Na+ Levamisole: inhibidor de ALP Pool de sueros de pacientes urémicos en hemodiálisis, sin medicación con posibles efectos sobre la calcificación. Pool de sueros de individuos sanos, ajustados en edad y sexo a los pacientes urémicos. Consentimiento informado por escrito

* * EFECTO DEL SUERO URÉMICO Curva de incorporación de 45Ca con 10% del suero indicado ( * p<0,01). S. UREM FBS S. NO UREM Tinción de Von Kossa. Día 12 El suero urémico indujo un incremento significativo de la captación de 45Ca y de la deposición de fosfatos cálcicos.

DEPENDENCIA DE LA CALCIFICACIÓN DE LA HIPERFOSFATEMIA * ** Medida de la incorporación de 45Ca. Efecto de PFA 1 mM (inhibidor del transportador P/Na+) y de Levamisole 1 mM (inhibidor de la ALP) * p<0,05 **p<0,001. El proceso de calcificación in vitro inducido por -glicerofosfato es dependiente de hiperfosfatemia.

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE BICARBONATO FBS Medida de la incorporación de 45Ca en medios con diferentes concentraciones de bicarbonato y medida del pH resultante S. NO URÉMICO S. URÉMICO El aumento de la concentración de bicarbonato en el medio de calcificación favorece la incorporación de 45Ca. Este efecto es significativamente mayor con el suero urémico.

* EFECTO DEL pH DEL MEDIO EXTRACELULAR pH medio de calcificación Medida de la incorporación de 45Ca La alcalinización del medio extracelular provoca un incremento de la incorporación de 45Ca (*p<0,01) La acidificación del medio extracelular provoca un descenso de la incorporación de 45Ca (*p<0,01)

* EFECTO DEL EIPA SOBRE LA INCORPORACIÓN DE 45Ca Western blot de marcadores de transformación osteoblastica Día Cbfa-1 ALP CONTROL EIPA 10 M 4 8 12 7,42 ± 0,04 7,53 ± 0,03 EIPA 10 M CONTROL * pH EXTRACELULAR ( p<0,05) Curva de incorporación de 45Ca El bloqueante del transportador Na+/H+, EIPA, provoca aumento en incorporación de 45Ca por el sistema. Esto coincide con un incremento del pH extracelular y de la expresión de los marcadores de transformación osteoblástica Cbfa-1 y ALP.

* EFECTO DE LA ALDOSTERONA SOBRE LA INCORPORACIÓN DE 45Ca Medida de la incorporación de 45Ca en presencia de diferentes concentraciones de aldosterona. La aldosterona provoca incremento de captación de 45Ca de forma dosis dependiente (p<0.05 respecto al basal).

CONCLUSIONES El suero urémico incrementa la calcificación de CMLV en cultivo. Esta calcificación es extracelular y depende de la presencia de hiperfosfatemia. El aumento de la concentración de bicarbonato y el pH del medio extracelular incrementan la incorporación de 45Ca por las CMLV. Este efecto es potenciado por el suero urémico. El bloqueo del transportador Na+/H+ por el EIPA y la exposición a aldosterona favorecen el proceso de calcificación vascular. Los hallazgos referidos son de importancia potencial para el manejo ácido-base y el eje renina-angiotensina-aldosterona en pacientes urémicos con tendencia a la calcificación.