Inducción de proteína recombinante b-Lactamasa

Tecnología de DNA recombinante: Herramientas 1 Aislamiento del gen 2. Clonación y expresión Producción de la proteína Transcriptasa reversa Enzimas de restricción Célula huésped DNA polimerasa Ligasa Clones Sonda de DNA Véctor Medio de cultivo

Inducción de proteínas recombinantes Las proteínas recombinantes son aquellas que obtenemos a partir de una especie o una línea celular distinta a la célula original. La proteína se obtiene por la expresión de un gen clonado en esa línea celular que nos interesa. Ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias: fácil de cultivar fácil de modificar genéticamente trabajo rápido alto rendimiento 80% Expresar un gen de eucariontes en bacteria..... conformación modificaciones postraduccionales .... depende de la complejidad de la proteína

Sistemas biológicos de producción de PR Bacterias E. coli B. subtilis Células eucariontes Hongos Levaduras Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris y otros metilotróficos Hongos filamentosos Células animales en cultivo Células de insecto en cultivo Plantas Maximizar la expresión de proteínas codificadas por genes clonados

Clonación del DNA DNA foráneo (secuencia que se desea clonar) Vector de clonación (vehículo) Organismo huésped (E. coli) Selección de vectores Vector híbrido o recombinante

Vector de clonación pET-24a(+)

Vector de recombinación pET- TEM-1 7200 bp

Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una zona promotora y otra terminadora de la transcripción

El sistema de expresión también debe tener las siguientes características: Cromosoma de Escherichia coli

Además el vector PET tiene la secuencia del promotor T7 y de LacO cerca de la secuencia del transgene

El inductor del operón lac que utilizaremos será el isopropiltiogalactósido (IPTG).

Análogos de la lactosa

COMPOSICIÓN. a) Genes estructurales (en tándem). gen lac z codifica para la β-galactosidasa el gen lac y que codifica para la permeasa de galactosido. el gen lac a, codifica para la acetiltransferasa de tiogalactósido.

b)Promotor Sitio donde la polimerasa de RNA se une al DNA antes del inicio de la transcripción. C) Operador Se localiza en traslape con el promotor , sirve como el sitio de unión para una proteína, que se conoce como represor.

d) Gen Regulador. El gen regulador puede estar cerca o lejos de los genes que están siendo regulados. El gen regulador codifica para una proteína específica, un producto denominado REPRESOR.

Procedimiento de proteína recombinante Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli transformado con vector, añadir a 15 mL de LB Incubar con agitación a 37 ͦC hasta OD600 0.6-0.8 Tomar T0 (1 mL) e inducir con IPTG 1 mM (final) Seguir incubando y tomar alícuotas (1 mL) cada 30 min por 2 h. Tomar 15 µL y mezclar con 10 µL de BC, desnaturalizar y correr en SDS-PAGE.

Peculiaridades de la cosntrucción: En el vector pET-TEM se insertaron los genes que codifican para dos proteínas: 1) β-lactamasa 2) OmpA Proteína de tránsito que se inserta en la membrana externa de las bacterias. (Pag 43 del manual) Por lo tanto: no se requiere la extracción de la β-lactamasa, esta será secretada al medio

Purificación de la proteína recombinante

RESULTADOS DEL SEMESTRE PASADO 30 60 90 120 30 60 90 120 min