R. Tabasco, T. Paarup, C. Janer, C. Pelaez, T. Requena SELECTIVE ENUMERATION AND IDENTIFICATION OF MIXED CULTURES OF Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. paracasei subsp. paracasei and Bifidobacterium lactis in fermented milk R. Tabasco, T. Paarup, C. Janer, C. Pelaez, T. Requena Microbiología de Alimentos Ana Paulina Flores García

INTRODUCCION Los productos lácteos fermentados son los medios más populares de la entrega de las bacterias probióticas en los alimentos. L. acidophilus  L. paracasei subsp. paracasei Bifidobacterium lactis 

INTRODUCCION Yogurt debe ser utilizado solamente cuando la leche es fermentada   Streptococcus thermophilus  Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus 

INTRODUCCION los métodos de cultivo independiente para la identificación de bacterias basados ​​en el análisis genético se han convertido en una herramienta valiosa.

INTRODUCCION La separación de género o especies específicas de los productos de PCR por electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE) para la detección e identificación de los lactobacilos y bifidobacterias.

OBJETIVO Desarrollar metodologías selectivos en placas para la enumeración e identificación de cultivos mixtos de S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. paracasei subsp. paracasei y B. lactis en los productos lácteos fermentados basado en un medio libre de antibióticos selectivos y diferentes condiciones de incubación.

MATERIALES Y METODOS Microorganismos y condiciones de cultivos Cepas: S. thermophilus RET-31  L. delbrueckii subsp bulgaricus LBY-27 L. acidophilus LA-5 L. paracasei subsp. paracasei LC-01, B. lactis BB-12 S. thermophilus se cultivó en caldo de M-17 con 2% de lactosa. Lactobacillus delbruecki subsp bulgaricus y B. lactis se cultivaron en condiciones anaerobias en caldo MRS con 0.05% l-cisteína hidrocloruro L. acidophilus se cultivo aeróbicamente en caldo MRS. Las incubaciones se llevaron a cabo por 18-24h a 37°C L.paracasei subsp. paracasei  se cultivo aeróbicamente en caldo MRS. Las incubaciones se llevaron a cabo por 18-24h a 30°C

MATERIALES Y METODOS Métodos selectivos B. lactis. Los medios se suplementaron con un 1.5% de agar bacteriológico e incubación por 72h S. thermophilus. Inoculación de diluciones apropiadas mediante la técnica de vertido en placa de agar M-17, 1% de lactosa e incubación a 45°C por 24h  L. delbrueckii subsp. Bulgaricus. diluciones en caldo MRS, con 0.2% de Tween80, se completo con 1% de fructosa, 0.8% de ácido hidrolizado de caseína, 0.05% de cisteína, y 1.5% de agar (MRS-fructosa). se incubo en jarras anaerobias a 45°C por 72 h. Colonias algodonosas-esponjoso de 2-3mm L. acidophilus. diluciones en caldo MRS fermentación enriquecido con 0.2% de Tween80, suplementado con 1% de maltosa, 0.05% de cisteína, y 1.5% de agar (MRS-maltosa). Se incubo 20% CO2  a 37°C por 72h. Colonias rugosas, planos, con bordes irregulares y diámetro de 1-2mm  L. paracasei subsp. paracasei. vertido en placa diluciones en caldo MRS suplementado con 1% de rafinosa, 0.05% LiCl, 0.05% de cisteína, y 1.5% de agar (MRS-rafinosa). Las placas se incubaron en jarras anaerobias a 45 ° C durante 72 h. colonias blancas, suaves y circulares de diámetro 2-3 mm

MATERIALES Y METODOS Prueba de eficiencia Precisión y exactitud. Se determino por la comparación entre los recuentos bacterianos obtenidos con métodos selectivos y de referencia. Reproducibilidad. fue probado por el análisis de muestras idénticas por dos operadores diferentes y el uso de diferentes equipos. Al mismo tiempo, se evaluó el efecto de la matriz para la enumeración de bacterias en la leche fermentada

Selectividad y análisis de especificidad Selectividad y análisis de especificidad. los cultivos de los cinco especies bacterianas se mezclaron en el nivel de 10 7UFC ml-1para cada cepa y diluciones apropiadas se inocularon en el medio selectivo

MATERIALES Y METODOS Enumeración de recuentos viables de bacterias Se analizo vida útil para el rendimiento de los métodos selectivos. Recuentos viables se determinaron en las muestras (1 ml) mediante el uso de diluciones decimales de serie preparados en solución de Ringer suplementado con 0.05% de cisteina

MATERIALES Y METODOS Identificación de colonias Se verifico mediante PCR la enumeración específica. Primers específicos para cada especie fueron diseñados dentro de las regiones de los genes que codifican ARNr 16S de S. thermophilus , L. paracasei subsp. paracasei , L.delbrueckii subsp. bulgaricus y L. acidophilus usando el módulo Lasergene PrimerSelect  Primers específicos para cada especie para la identificación de B. lactis fueron diseñados sobre la base de las regiones variables de genes transaldolasa

MATERIALES Y METODOS Análisis PCR-DGGE Con el fin de obtener ADN bacteriano a partir de leche fermentada, las muestras se neutralizaron a pH 6.5 NaOH 1m y adición de EDTA 0.2% 10 ml, pH 12, para causar la dispersión de micelas de caseína. Las células bacterianas se recogieron por centrifugación y se mezcló (1:1) con perlas de vidrio, se recogieron por centrifugación y se obtuvo ADN genómico a partir del extracto libre de células  

ADN se utilizó como plantilla para la amplificación por PCR 40-bp GC (5'-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GGG GCA GCG CGG GGG G-3 ') para obtener productos de la PCR adecuados para la separación por DGGE .

RESULTADOS Comparacion de recuentos bacterianos usando metodos selectivos y de referencia La incubación en aerobiosis a 45°C por 24h en agar M17-lactosa se ​​encontró adecuado para la enumeración selectiva de S. thermophilus, impidió el crecimiento de L. paracasei subsp.paracasei, L. delbrueckii subsp. bulgaricus y B. lactis crecieron en condiciones anaeróbicas. La extensión del período de incubación de 48 h permitió colonias en forma de puntos de L. acidophilus 

RESULTADOS Enumeración de bacterias en productos de leche fermentada usando los métodos selectivos

RESULTADOS Identificación por PCR-DGGE de las especies presentes en leche fermentada la técnica permite una separación distinguible de fragmentos, que muestra un gran potencial detección e identificación para el análisis de estos productos

CONCLUSIONES La elección de los métodos se basa en patrones de fermentación de hidratos de carbono y la incubación a diferentes temperaturas y condiciones atmosféricas que se dirigen a las especies presentes en el producto. La eficiencia de los métodos selectivos se verificó mediante la evaluación del rendimiento usando parámetros estadísticos tales como precisión, exactitud, reproducibilidad, la selectividad y especificidad, y por la identificación de las especies enumeradas por especies específicas de PCR. Como ventaja complementaria, este estudio también demuestra que la combinación de análisis de PCR y DGGE específico de la especie muestra un gran potencial de detección y la identificación para la verificación de las especies precisa de etiquetado en la leche fermentada sin aislamiento previo de las bacterias.